创伤诱导毛囊新生及IL-36α对毛囊作用的机制研究
发布时间:2020-03-29 11:09
【摘要】:背景与目的:创伤诱导毛囊新生是一种广泛存在于成年哺乳类动物皮肤上的再生现象,即在一定大小的全层皮肤创伤愈合后的中心区域能够新生出全功能性的毛囊。创伤后的毛囊新生的机制更类似于胚胎源性的毛囊新生。表皮干细胞、成纤维细胞、角质形成细胞及一些免疫细胞都参与了创伤后诱发毛囊新生的调控。对创伤诱导毛囊新生的研究有助于我们更深入的探索哺乳动物的生长发育及再生分子学机制,并且能够指导临床毛发相关疾病的治疗。蛋白组学是在后基因组时代中崛起的新兴学科,它能为揭示生命本质的提供直接的物质基础。同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术是近年来研究蛋白组学最常用的的高通量筛选技术。它能够定量分析两组样品蛋白的表达情况,进而从筛选出的差异蛋白中寻找调控表型的靶点。在目前创伤诱导毛囊新生的研究中,炎症因子的调控作用受到了较多关注。我们通过高通量的蛋白组学分析,筛选出预测能够调控毛囊生长发育的蛋白质分子,发现IL-36α在小鼠创伤愈合后的毛囊生长区域高表达。IL-36α作为IL-1家族的前炎症因子,能够促进多种炎症因子,如IL-1、IL-6、TNFα等表达。因此本研究进一步探讨了IL-36α对创伤诱导毛囊新生的调控作用。材料与方法:1、创伤模型鼠建立:出生后49天大小雌性野生C57BL/6小鼠,背部造1.5cm×1.5cm方形全层创伤。2、阻碍伤口愈合对毛囊新生的影响:将20只创伤模型鼠随机等分成2组,实验组用线将伤口边缘与皮下肌肉组织缝合在一起,对照组不做处理。创伤后第0、3、5、7、10、14、22天数码照相机拍照,统计伤口或愈合面积大小。创伤后第28天切取愈合区域皮肤组织,碱性磷酸酶染色,计数新生毛囊数,观察创伤后诱导新生毛囊的特点。3、创伤愈合区域中有毛囊新生区域与无毛囊新生区域蛋白组学的差异:45只创伤模型鼠,随机等分成3组,取创伤后第15天小鼠背部瘢痕区域皮肤,分成内、外组织两部分,将每组的内和外组织分别混合成一组样品,共3对样本进行iTRAQ技术分析,对筛选出的差异蛋白进行生物信息学分析,预测与创伤诱导毛囊新生相关蛋白分子进行后续功能验证。4、IL-36α对创伤诱导毛囊新生和毛发生长周期的作用:20只创伤模型鼠,随机等分成PBS注射对照组和鼠源重组IL-36α(mr-IL-36α)注射实验组2组,对照组和实验组在创伤后第7-14天每日分别于痂下注射50μl PBS溶液或50μl mrIL-36α(1ng/μL,PBS配)溶液。观察并拍照记录创面愈合情况及毛囊新生情况,计数新生毛囊数量。49天和65天C57bl/6小鼠各5只,背部左侧皮内注射mr-IL-36α100μl,右侧皮内注射PBS 100μl。观察并拍照记录毛发生长情况。5、通过qPCR、流式、免疫组化等方法探究IL-36α对表皮及毛囊干细胞、相关炎症因子及Wnt经典信号通路的调控。结果:1、创伤后第12-14天左右结痂脱落,测量创伤后第0、3、5、7、10、14、17、22天伤口或瘢痕的面积,阻碍伤口愈合组与对照组相比,其面积缩小的程度减慢。在创伤后第7、10、14、17、22天时,两组的创伤区域面积大小存在统计学差异(p0.05)。创伤后第28天创伤愈合区中间存在新生毛囊,其数量与瘢痕面积的大小存在正相关性(rs=0.729,p0.001)。2、对创伤后第15天的创伤愈合区域进行iTRAQ高通量蛋白分析技术分析,共检测出4378个蛋白,无新生毛囊区与有新生毛囊区相比存在129个差异蛋白(差异倍数≥1.5 or≤0.667,p0.01),其中46个蛋白上调,83个蛋白下调。GO分析示在生物学功能条目中,参与细胞过程的蛋白所占比例最高(58.14%),在细胞组成条目中,定位于细胞上的(包括细胞膜、细胞壁、细胞外膜)蛋白所占比例最高(71.72%),在分子功能条目中,起到连接作用的蛋白所占比例最高(55.81%)。KEGG分析示富集在核糖体相关信号通路的蛋白最多。多个蛋白分子与毛囊的生长发育有关,其中IL-36α在有毛囊新生区域高表达(FC=0.556,p0.01)。3、IL-36α促进创伤诱导毛囊新生及毛发周期转化:创伤后第15天,qPCR检测示IL-36αmRNA在有新生毛囊区的表达量是无新生毛囊区的26倍(p0.05);western blot检测示,IL-36α在创伤愈合的中间区域即有毛囊新生区域高表达。IL-36α处理的创伤模型鼠在第10天左右脱痂,对照组在第12天左右脱痂,IL-36α处理组的创伤后诱导毛囊新生的数量高于对照组(p0.01)。毛发处于静止期晚期小鼠,背部IL-36α处理区域毛囊进入生长期的时间早于PBS处理区域。4、IL-36α促进表皮干细胞及毛囊干细胞增值:qPCR检测IL-36α处理侧K15、CD34、Lgr5和Lgr6的基因表达水平高于对照侧(p0.05),流式细胞技术检测示,IL-36α处理侧表皮细胞中CD49f~+CD34~+毛囊干细胞比例高于对照侧(p0.05),CD34~-CD49f~+Pcad~(hi)毛囊前体细胞的比例无明显统计学差异。免疫荧光检测示IL-36α处理部位K15表达水平高于对照侧。免疫组化结果示IL-36α处理部位Lgr6表达水平高于对照侧。5、IL-36α对经典Wnt通路无调控作用但能上调β-catanin及相关炎症因子表达:qPCR检测示IL-36α处理侧TNFα、TCRVγ3、IL-6和β-catanin的基因表达水平高于对照侧(p0.05),但其他Wnt相关因子,如LEF-1、Wnt5a、DKK-1、Lrp5,无明显差异(p0.05)。western blot检测示IL-36α处理部位STAT3磷酸化水平高于对照侧。结论:1、阻碍伤口收缩使瘢痕的面积增大,促进创伤诱导毛囊的生成。2、创伤诱导毛囊新生模型的新生毛囊主要集中在瘢痕中间区域,有毛囊新生区域与无毛囊新生区域具有蛋白表达的差异,其中IL-36α在有毛囊生长区域高表达。3、IL-36α能够通过促进表皮干细胞及毛囊干细胞的增值促进伤口愈合、创伤诱导毛囊新生及促进静止期晚期毛囊向生长期转化。4、IL-36α通过促进炎症因子的分泌诱导了STAT3磷酸化及β-catanin相关通路激活,促进了毛囊生长。
【图文】:
后天数 1 组 (cm2) 2 组(cm2)0 2.25 2.253 1.458±0.422 1.543±0.265 1.17±0.323 1.313±0.2087 0.609±0.173 0.913±0.11410 0.201±0.104 0.423±0.12914 0.184±0.098 0.319±0.18317 0.117±0.051 0.236±0.13522 0.079±0.042 0.184±0.06
5图 2 第 1 组与第 2 组小鼠创伤愈合随时间的变3.2 干预措施对创伤诱导毛囊新生的影响创伤后第 28 天,1 组瘢痕的面积平均值为 0.192±0.091平均值为 0.361±0.189 cm2(表 2)。新生毛囊的数量与瘢痕的p<0.001)(图 3)。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R751
【图文】:
后天数 1 组 (cm2) 2 组(cm2)0 2.25 2.253 1.458±0.422 1.543±0.265 1.17±0.323 1.313±0.2087 0.609±0.173 0.913±0.11410 0.201±0.104 0.423±0.12914 0.184±0.098 0.319±0.18317 0.117±0.051 0.236±0.13522 0.079±0.042 0.184±0.06
5图 2 第 1 组与第 2 组小鼠创伤愈合随时间的变3.2 干预措施对创伤诱导毛囊新生的影响创伤后第 28 天,1 组瘢痕的面积平均值为 0.192±0.091平均值为 0.361±0.189 cm2(表 2)。新生毛囊的数量与瘢痕的p<0.001)(图 3)。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R751
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本文编号:2605883
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