沙眼衣原体患者血清中存在GPIC噬菌体衣壳蛋白Vp1的抗体

发布时间：2020-05-05 16:46

【摘要】： 沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,C.t)是引起生殖道衣原体感染(Genitalchlamydial infection)的主要病原体占40%～50%。沙眼衣原体感染目前已是西方国家最常见的性传播疾病之一,发病人数增加很快,已超过淋病。在我国,沙眼衣原体感染的患病人数也在迅速增加。感染者可以有症状或无症状,因此诊断常很困难。沙眼衣原体感染可引起男性前列腺炎、附睾炎、直肠炎、女性盆腔炎、不孕症、异位妊娠等并发症,造成严重的后果。同时由于治疗抗生素选择不当、用量小、时间短等滥用抗生素日趋严重使沙眼衣原体耐药性问题突出,加大了治疗的困难。因此,近些年来国内外研究学者扩大了对沙眼衣原体研究的广度和深度。其中,针对衣原体噬菌体的研究得到关注,噬菌体噬菌体(Phage)是一种感染细菌的病毒,它能使所寄生的细菌病变并解体,可被广泛地用于阻挡和治疗感染,在抗生素耐药日趋严重的情况下,噬菌体抗感染的研究受到了广泛重视。本课题旨在通过对衣原体GPIC噬菌体衣壳蛋白Vp1的表达、鉴定、提纯,获得Vp1蛋白,同时收集206例沙眼衣原体感染者的血清筛检出Vp1抗体。明确衣原体感染者衣原体噬菌体的存在,对于沙眼衣原体感染所致的生殖道衣原体感染的治疗预防等多方面的研究有重要价值。目的:通过实验研究,获得衣原体噬菌体φCPG1的衣壳蛋白Vp1蛋白。收集沙眼衣原体感染者的血清,以便筛选出衣原体噬菌体Vp1蛋白的抗体,明确噬菌体的存在。促进对沙眼衣原体与噬菌体的进一步研究。方法:挑取带有原核表达质粒Vp1-pET-30a(+)重组质粒菌接种于LB液态培养基中进行诱导表达,部分纯化,离心收集不溶蛋白。按蛋白提纯试剂盒说明进行纯化,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯化后的Vp1蛋白。应用考马斯亮蓝法进行定量分析推算Vp1蛋白浓度。将复性后的Vp1蛋白免疫小鼠3次后内眦静脉取血收集血清,检测免疫后鼠血清Vp1抗体。ELISA筛选含Vp1抗体的血清:包被Vp1蛋白于96孔酶联板条中4℃过夜,PBST洗涤,用含3%BSA的封闭,对84例正常人和206份C.t感染者血清样本分别进行ELISA测定OD_(405),比较二者的检测结果。应用Western blot将纯化的Vpl蛋白转移至硝基纤维素膜上,3%奶粉-TBST液封闭,将免疫小鼠血清、未感染C.t者血清、ELISA阳性结果的血清都以用1%奶粉-TBST稀释为1:500孵育过夜,TBST清洗,加入碱性磷酸酶标记的羊抗人的IgG抗体1:10000孵育,BCIP/NBT显色后即用水终止反应,观察颜色变化鉴定Vp1抗体。结果:带有原核表达质粒Vp1-pET-30a(+)重组质粒菌进行诱导表达,收集沉淀蛋白。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳观察在62000处有一比其他杂带都宽大的条带,此为Vp1蛋白。提纯蛋白后获得目的条带,既为纯化后的Vp1蛋白。透析复性提纯的目的蛋白,使Vp1蛋白具有抗原性。使用考马斯亮蓝法进行蛋白定量,可得到推算的蛋白浓度,用以免疫小鼠和ELISA测定。纯化后的Vp1蛋白以10/ml包被孔板,将免疫小鼠血清、正常人类血清分别以不同稀释度进行孵育,发现在1:400稀释度下阳性血清OD_(405)/阴性血清OD_(405)=2.5496,比值差别最大,既此滴度下阴阳性血清较差的可能性最小。最终确定以1:400为最适血清稀释度。待测血清样品OD_(405)≥0.102判为阳性,反之判为阴性。按此标准,测定206个临床判定为C.t感染者血清OD_(405),共有18人判为阳性,考虑其血清中可能具有Vp1抗体。使用Western对18例ELISA阳性者血清中vp1蛋白的抗体进行明确鉴定,发现4例血清具有Vp1抗体,从而发现C.t感染者血清中Vp1抗体的存在。结论:1.实现了沙眼衣原体GPIC噬菌体φCPG1的衣壳蛋白Vp1的表达、鉴定、提纯。2.测得纯化后的Vp1蛋白浓度,免疫小鼠检测免疫原性。3.通过ELISA法筛选出18例泌尿生殖道C.t感染者血清显示Vp1蛋白的抗体。4.进行Western blot鉴定其中4例具有vp1蛋白特异性抗体,探索沙眼衣原体患者血清中存在衣原体噬菌体的可能性。
【图文】：

菌液,抗菌素,平板筛,诱导表达

菌液超声前后比较

抗菌素,平板筛,重组质粒,卡那霉素

结果一目的蛋白诱导、表达1.重组前后不同菌落在LB培养基上的生长状态(见图1一1)。带有Vpl一pET-3Oa(+)重组质粒菌BLZI可以在含有卡那霉素的平板较好的生长，只带有pET-3Oa(+)的空质粒菌BLZI在含有卡那霉素的平板也有菌落生长，不含质粒的BLZI可以在不含有卡那霉素的平板生长。[l]图 Vp123为带Vpl一pET-30a(+)重组质粒菌BLZI在含有卡那霉素的LB培养基上的生长状态[2]图LA4为只带有pET-30a(+)的空质粒菌BLZI在含有卡那霉素的LB培养基上的生长状态[3」图BLZI为不含质粒的BLZI在不含有卡那霉素的LB培养基上的生长状态。图1:重组质粒的抗菌素平板筛选2.菌液诱导表达后分别经49%振幅超声65间隔105共12次、20%的振幅超声105间隔105共2次超声碎菌，，浑浊的菌液变得澄清。左试管为超声前菌液;右试管为超声后的菌较前更为清亮。图2:菌液超声前后比较二.重组子诱导产物SDS一队GE电泳结果
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R759

【参考文献】