二甲双胍对A431细胞中FAK及paxillin作用的研究

发布时间：2020-05-12 03:36

【摘要】：目的:皮肤鳞状细胞癌(Cutaneous squamous cell carcinoma,CSCC)起源于表皮或附属器角质形成细胞,是一种常见的皮肤恶性肿瘤。近年来发病率不断升高,而目前对于皮肤鳞癌的治疗,临床上主要以手术为主,放射治疗、光动力疗法、冷冻治疗或多种方法的综合疗法也常用于临床,手术联合其他疗法的效果可能会更明显,但药物治疗的效果欠佳。随着国内外研究的不断深入,新的抗肿瘤药物及新的作用靶点不断的被发现,糖尿病一线用药二甲双胍作为老药被新用,二甲双胍被不断的发现能作用于多种恶性肿瘤,例如乳腺、卵巢、结肠、前列腺等部位的恶性肿瘤,以及皮肤恶性肿瘤如恶性黑色素瘤、鳞状细胞癌等。二甲双胍抗肿瘤有多种作用机制,国内外研究发现二甲双胍可通过多条信号通路来调控细胞能量代谢、抑制蛋白质合成、诱导细胞周期停止、诱导细胞凋亡,亦可与其他抗肿瘤药物联合应用增强其他抗肿瘤药物的细胞毒性等,从而来达到促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移的效果。粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是一种胞质非受体蛋白酪氨酸激酶,是粘着斑复合物家族的一员。桩蛋白(PaxiIIin)是一种胞质内的关键衔接蛋白,是FAK下游的焦点黏附调节蛋白之一,主要定位于黏着斑。可调控多条下游信号通路,包括P13K/Akt、p53和RAS/Erk等,故FAK及Paxillin是胞内外信号转导的中枢。阻断FAK及Paxillin的活化及表达可以阻断多条肿瘤增殖侵袭相关的信号通路,因此抑制FAK及Paxillin的表达、降低其活性有望成为肿瘤治疗的一个新的作用靶点。二甲双胍已经被证明可以通过PI3K/Akt、RAS/Erk等信号通路抑制A431鳞癌细胞的生长、侵袭及转移,本实验研究旨在探讨二甲双胍对皮肤鳞状细胞癌A431细胞的抑制作用及对FAK和Paxillin的磷酸化及转录表达的影响,探寻二甲双胍对CSCC作用的新机制。方法:1.细胞来源:人皮肤鳞状细胞癌细胞株A431细胞。2.实验分组:实验根据不同的药物浓度分组,设IMDM培养基中二甲双胍的浓度分别为1.25mM、2.5mM、5mM、10mM为4个实验组,以不加药物组为对照组。3.采用Transwell细胞迁移和侵袭实验检测各组细胞在不同浓度的二甲双胍作用24h后的迁移和侵袭的能力。4.采用蛋白质免疫印迹(western blot)技术检测经不同浓度的药物处理的各组细胞中提取的总蛋白中FAK、p-FAK、Paxillin、p-Paxillin的蛋白相对表达量。5.采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测各组细胞中FAK、Paxillin mRNA基因的转录情况。6.采用细胞免疫荧光检测对照组与实验组中磷酸化的FAK及Paxillin表达情况。7.统计学分析:采用SPSS19.0软件统计分析,计量资料服从正态分布用?χ±s表示,并且方差齐时采用单因素方差分析;不服从正态分布用中位数及四分位数间距(m±q)表示,或方差不齐时采用非参数检验。两两比较方差齐时采用SNK-q检验,方差不齐采用Tamhan’S T2检验。组间差异及两两比较均以P0.05为差异有统计学意义。结果:1.Transwell迁移和侵袭实验结果显示二甲双胍作用后的A431细胞其迁移和侵袭能力减弱:A431细胞经二甲双胍培养24h后,迁移实验中各组穿膜细胞数分别为分别为113.0±14.32、85.33±6.46、83.44±7.47、71.89±7.22、60.56±4.21,除1.25mM与2.5mM组差异无统计学意义外(P0.05),其余各组两两比较差异均有统计学意义(P0.01);侵袭实验中各组穿膜细胞数分别为91.44±4.10、78.78±4.99、67.11±4.83、58.22±5.43、38.22±8.67,各组两两比较差异均有统计学意义(P0.01)。两组实验中穿过小室膜的细胞数随药物浓度的升高而呈减少的趋势。2.免疫荧光实验观察经二甲双胍处理后的A431细胞中p-FAK及p-Paxillin在胞浆中的表达分布情况:二甲双胍作用于细胞12小时后,可见细胞浆中p-FAK及p-Paxillin的表达随药物浓度的升高呈减弱的趋势。3.药物处理细胞12h后不同药物浓度(0mM、1.25mM、2.5mM、5mM、10mM)对细胞总蛋白中p-FAK及p-Paxillin蛋白表达的影响:各组细胞p-FAK蛋白相对表达量分别为:0.65±0.14、0.49±0.16、0.39±0.21、0.36±0.23、0.16±0.09;p-Paxillin蛋白相对表达量分别为:0.56±0.07、0.45±0.09、0.29±0.14、0.19±0.08、0.11±0.1。各组间差异均有统计学意义(P0.01)。提示总蛋白中p-FAK及p-Paxillin的相对表达量随药物浓度的增加均呈下降的趋势。4.经二甲双胍培养细胞12h后不同药物浓度(0mM、1.25mM、2.5mM、5mM、10mM)对总蛋白中非磷酸化FAK及非磷酸化Paxillin表达的影响:各组FAK蛋白相对表达量分别为:0.98±0.21、0.97±0.19、0.99±0.11、0.95±0.20、0.99±0.09;各组Paxillin蛋白相对表达量分别为:1.01±0.17、1.08±0.16、0.98±0.12、0.95±0.09、1.12±0.21。两组间差异无统计学意义(P0.05),提示总蛋白中FAK及Paxillin的相对表达量随药物浓度的增加变化不明显,说明二甲双胍对其在A431细胞中的表达影响不明显。5.利用qRT-PCR技术检测FAK mRNA、Paxiilin mRNA在不同二甲双胍浓度(0mM、1.25mM、2.5mM、5mM、10mM)下的相对表达量:FAK mRNA的相对表达量分别为1.00±0.00、1.02±0.06、0.98±0.06、1.05±0.08、0.99±0.11,组间差异无统计学意义(P0.05);Paxillin mRNA的相对表达量分别为1.00±0.00、1.05±0.05、1.03±0.08、1.04±0.04、1.09±0.12,组间差异无统计学意义(P0.05)。提示FAK及Paxiilin mRNA的相对表达量随药物浓度的变化无明显差异,可能二甲双胍对其转录表达的影响不明显。结论:1.二甲双胍可抑制A431细胞的迁移及侵袭。2.二甲双胍可抑制FAK及Paxillin的磷酸化,但对其转录及表达影响不明显。
【学位授予单位】：承德医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.5

【参考文献】