醌茜素的合成优化及其诱导黑色素瘤A375细胞凋亡的机制

发布时间：2020-05-16 21:59

【摘要】：恶性黑色素瘤是一种危险程度极高的皮肤肿瘤,其具有预后性差、易转移和侵袭的特点,严重地威胁着人类生命健康。相关研究显示晚期黑色素瘤对多数化疗药物具有抗性,因此,寻找能够有效治疗黑色素瘤的药物尤为重要。醌茜素是从茜草科植物中萃取的蒽醌类化合物,具有抗炎,抗肿瘤的作用,被认为是一种高效、高选择的细胞膜通透性药物。然而,醌茜素从植物提取量极低,本研究以期通过优化合成醌茜素反应条件中的反应时间、反应温度和底物摩尔配料比来提高醌茜素的合成产率,并验证其生物活性,进而探索醌茜素对人黑色素瘤A375细胞的作用机制,为黑色素瘤治疗及新药开发提供一定的理论依据。本实验以1,4-二羟基蒽醌、偏硼酸和98%浓磷酸为底物,在高温条件下,经氧化还原反应来制备醌茜素,并对合成工艺中反应条件进行优化,当反应时间为2.1 h、反应温度为221℃和底物摩尔配料比为1.2:1.4:1.6时,醌茜素产率达到最大值96.24%,通过质谱测量合成产物的相对分子量与醌茜素一致;通过MTT比色法检测醌茜素对人黑色素瘤A375细胞增殖的抑制作用,结果显示醌茜素以浓度依赖性的方式抑制人黑色素瘤A375细胞增殖,与阳性对照药物5-FU相比具有差异显著;用Annexin V-FITL/PI双染法染色观察细胞凋亡形态,发现随着醌茜素处理时间的延长,细胞凋亡和坏死的荧光强度不断增强,同时,采用流式细胞术和蛋白质免疫印迹方法检测细胞凋亡,细胞凋亡率以时间依赖的方式增加,且通过抑制抗凋亡蛋白Bcl-2和激活促凋亡蛋白Bad,caspase-3和PARP的表达水平来调控凋亡;利用流式细胞术检测醌茜素诱导黑色素瘤A375细胞周期分布情况,醌茜素通过抑制cyclin A和cyclinB蛋白和激活CDK1/2、p21和p27蛋白的表达水平,触发黑色素瘤A375细胞周期阻滞在G2/M期;用蛋白免疫印迹方法对信号通路相关蛋白表达水平检测表明醌茜素上调p-JNK,p-p38,I-κB的表达水平和下调p-AKT,p-ERK,p-STAT3,NF-κB的表达水平诱导细胞凋亡;采用流式细胞术和蛋白质免疫印迹进一步评价了醌茜素对黑色素瘤A375细胞内活性氧(ROS)的影响,醌茜素加速了细胞内活性氧的产生,同时,ROS清除剂(NAC)的使用促进了p-AKT,p-ERK,p-STAT3,NF-κB和Bcl-2的表达,而抑制了p-JNK,p-p38,I-κB,Bad,caspase-3和PARP表达,导致细胞内ROS产生及细胞凋亡受到抑制;最后,采用蛋白质免疫印迹检测醌茜素诱导凋亡中MAPK和STAT3的关系,结果表明醌茜素诱导黑色素瘤A375细胞凋亡中STAT3受到MAPK的调控。通过对合成工艺中反应时间、反应温度和摩尔配料比的优化,提高了醌茜素的合成产率,降低了成本;醌茜素能够有效抑制黑色素瘤A375细胞增殖,且通过触发细胞周期阻滞在G2/M期和促进ROS介导的AKT,MAPK,STAT3和NF-κB信号通路诱导A375细胞凋亡。
【图文】：

文献综述细胞周期阻滞、分解代谢和生长抑制和组织特异性代谢[58]。AKT 可以直接抑制促凋亡信号Bcl-2 和 Forkhead 家族转录因子促进细胞的存活，AKT 级联反应被许多机制异常激活对恶性肿瘤的抑制凋亡、细胞逃避和不规则增殖具有重要意义[59]。在细胞内发挥着抑制肿瘤细胞凋亡、促进增殖的关键作用[60]。AKT 成为一个可行的癌症治疗药物靶点。

醌茜素的合成优化及其诱导黑色素瘤 A375 细胞凋亡的机制受到环境胁迫和炎性细胞因子的影响，，ASK1 的磷酸化导致 MAPK 激酶 MKK3、MKK4 哥和 MKK6 活化激活了 p38 途径[65]。P38 信号通路途径参与负向调节细胞的增殖、分化、存活、迁移和氧化应激介导的肿瘤起始的功能，说明 p38 信号转导可以抑制肿瘤的形成和发展[66]。
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.5

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本文编号：2667401