申克孢子丝菌线粒体DNA型别与临床分型的关系

发布时间：2020-05-17 14:11

【摘要】： 目的 用常规真菌学方法比较不同临床型别的申克孢子丝菌分离株的真菌学特点,并了解中国辽宁地区的申克孢子丝菌线粒体DNA分型,探索其线粒体DNA分型与临床表现型之间的关系。 材料与方法 一、实验菌株 47例皮肤型孢子丝菌病患者均来自于本院皮肤科,皮损处组织块或脓汁培养的致病菌经大培养菌落形态特征和小培养镜下特点鉴定为申克孢子丝菌,其中男16例,女31例,年龄2～86岁;固定型24例,淋巴管型23例。 二、实验试剂 1、菌体培养基 (1)沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂固体培养基 (2)改良沙氏液基 2、线粒体DNA提取试剂 (1)EDTA缓冲液 (2)破壁酶Zymolyase 100T (3)2-巯基乙醇 (4)20%SDS(十二烷基磺酸钠) (5)Tris饱和酚 (6)氯仿、异丙醇、无水乙醇 (7)TE缓冲液 3、酶切及电泳试剂 (1)HaeⅢ酶 (2)RNase A酶 (3)琼脂糖 (4)0.5×TBE储存液 三、主要实验仪器 1、蒸汽高压消毒箱(美国Tuttnauer 2540MK型) 2、PH4000AB型电热恒温培养箱(天津市泰斯特仪器有限公司) 3、紫外凝胶成像系统(英国Gel WOrker eD,UVP GDS 8000) 4、全能型高性能台式冷冻离心机(德国Heaeus,Biofuge Stratos) 5、05RP-22离心机(Hitachi提供) 6、HZO-X100震荡培养箱(哈尔滨市东联电子开发有限公司) 7、电泳仪(北京六一仪器厂,DYY-Ⅲ2型) 8、电泳槽(北京六一仪器厂,DYY-Ⅲ2型) 9、超声细胞破碎仪(up 50H ultraschallprozessor) 四、实验方法 1、菌株培养 将47株分离菌株分别接种于沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂(SDA)固体培养基,2周后于菌体培养及镜下观察形态。 2、线粒体DNA提取 3、限制性酶切 4、琼脂糖凝胶电泳并照相 结果 1、菌体培养 将47株孢子丝菌病分离菌株接种于沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂固体培养基,观察发现47株申克孢子丝菌菌株基本一致: (1)SDA固体培养基示:1周时呈直径约0.5cm菌落,淡褐色或白色平滑酵母样菌落,表面湿润成膜状。2周时菌落直径约2cm,中央凹陷,周边隆起,出现皱褶,呈深褐色。 (2)镜下示:细长分隔菌丝,分生孢子柄多与菌丝呈直角生长,顶端着生梨形或卵圆形孢子,呈梅花瓣状分布,并见孢子沿菌丝侧生。 2、线粒体DNA分型 对47株申克孢子丝菌进行线粒体DNA分型,得4,5,6,20及24型共五种带型,由8或9条带组成。这五个型别的共有带分别为10kb、4.5kb、3.6kb、1.9kb、1.25kb、0.86kb和0.75kb。5型与20型的区别在于5型比20型多了一条0.96kb的带;6型与24型的区别在于二者第二条带的位置不同,即6型的第二条带位于8.2kb处,而24型的第二条带位于6.4kb处。 3、线粒体型别与临床分型 (1)该47株申克孢子丝菌经线粒体DNA分型,线粒体DNA 4型有40株,6型有3株,5型有1株,20型有1株,24型有2株。 (2)来源于临床固定型的申克孢子丝菌菌株共有24株,4型有22株,余为6型;来源于临床淋巴管型的申克孢子丝菌菌株共有23株,其中4型有18株,6型有1株,5型有1株,20型有1株,24型有2株。 4、统计学分析 (1)对申克孢子丝菌的线粒体DNA分型和孢子丝菌病的临床型别进行统计分析,采用χ~2检验,P＜0.1,可认为申克孢子丝菌的临床型别中的淋巴管型和固定型均与线粒体DNA分型中的4型相关。 (2)此外,就本实验中的47例患者进行了临床型别与性别之间的关联假设,采用χ~2检验,P＞0.1,故可认为申克孢子丝菌病的临床分型(淋巴管型和固定型)与患者性别之间无相关性。 本研究用常规真菌学方法对淋巴管型和固定型孢子丝菌病的致病菌株进行观察比较,并研究了皮肤型孢子丝菌病的致病菌线粒体DNA分型与临床型别之间的关系,得出以下结论:①用常用真菌形态学方法无法区分来源于不同临床型别的申克孢子丝菌分离菌株。②淋巴管型和固定型孢子丝菌病与患者性别之间无明显相关性。③中国辽宁地区的申克孢子丝菌由4、5、6、20及24型组成,4型在辽宁地区占有绝对优势。④线粒体DNA分型为4型的申克孢子丝菌菌株可能与淋巴管型及固定型孢子丝菌病有关,该型菌株在体内是否更容易引起淋巴管型和固定型皮损有待进一步研究。
【图文】：

(1)SDA固体培养基示:1周时呈直径约0，scm菌落，淡褐色或白色平滑酵母样菌落，表面湿润成膜状。2周时菌落直径约Zcm，中央凹陷，周边隆起，出现皱褶，呈深褐色，见图1。(2)镜下示:细长分隔菌丝，分生抱子柄多与菌丝呈直角生长，顶端着生梨形或卵圆形抱子，呈梅花瓣状分布，并见抱子沿菌丝侧生，见图2。图1，SDA固体培养基(左图2，镜下可见梅花瓣状分生淋巴管型，右固定型)抱子2、线粒体DNA分型(1)对47株申克抱子丝菌进行线粒体DNA分型，得4，5

5型与20型的区别在于5型比20型多了一条0.%kb的带;6型与24型的区别在于二者第二条带的位置不同，，即6型的第二条带位于8.Zkb处，而24型的第二条带位于6.4kb处，见图3。 4788692274灼93图3，经线粒体DNA分型得到的五种带型:泳道1为mtDNA4型，泳道2为mtDNAZO型，泳道3为mtDNAS型，泳道4为mtDNA6型，泳道5为mtDNA24型，M:I又一EcoT4ldigesrDNAMarker。3、线粒体型别与临床分型(1)该47株申克抱子丝菌经线粒体DNA分型，线粒体DNA4型有40株
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R756.9;R450

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本文编号：2668679