RNA干扰技术对犬小孢子菌PQ-LRP基因沉默的研究及面部线状红斑狼疮1例

发布时间：2017-03-27 10:04

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【摘要】：目的： 在本课题组前期采用cDNA快速末端扩增法（RACE）得到膜蛋白PQ-LRP基因全长序列后，本实验拟构建犬小孢子菌PQ-LRP基因RNA干扰载体，探究RNA干扰载体对犬小孢子菌PQ-LRP基因表达的影响，构建PQ-LRP基因RNA干扰株，为后期探讨此基因在发病机制中的作用提供理论基础及新型药物的开发提供设计靶位。 方法： 1、提取总RNA，反转录为cDNA作为PCR模板，，用引物LRP-F和LRP-R扩增LRP基因的干扰序列，来得到长度为600bp的正向干扰片段，连接到PUC-PUT载体的Ptrpc启动子和间隔序列之间，拟得到中间载体PUC-PLUT；再次用引物LRP-F和LRP-R扩增LRP基因的干扰序列，来得到长度600bp的反向干扰序列连接到PUC-PLUT载体的间隔序列和Ttrpc终止子之间，拟得到中间载体PUC-PLULT，与PCB309进行连接，最终构建出干扰载体PCB309-PLULT。 2、根据潮霉素不同浓度对照法，确定筛选犬小孢子菌转化子的潮霉素最佳浓度。 3、采用电击法将含有干扰载体PCB309-PLULT的质粒转入根癌农杆菌中，利用根癌农杆菌转化体系对犬小孢子PQ-LRP基因进行沉默。 4、应用Real Time PCR方法检测PCB309-PLULT载体对犬小孢子菌PQ-LRP基因表达的干扰作用。 结果： 构建了中间载体PUC-PLUT、PUC-PLULT，并通过PCR、基因测序进行鉴定；成功构建了长为8825bp的干扰载体PCB309-PLULT，并通过酶切测定为该目的载体；筛选出犬小孢子菌转化子的潮霉素最佳浓度为300μg/ml；用实时定量PCR方法对犬小孢子菌干扰前后进行鉴定：以干扰前PQ-LRP相对表达量1.0为标准，干扰后PQ-LRP相对表达量为0.39，干扰后下调61%。 结论： 成功构建的干扰载体PCB309-PLULT可以明显抑制犬小孢子菌PQ-LRP基因的表达，并成功构建了PQ-LRP基因干扰株，为研究膜蛋白PQ-LRP基因在犬小孢子菌致病中的功能奠定基础。
【关键词】：RNA干扰 犬小孢子菌 PQ-LRP基因
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R758.62
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 第一部分 RNA 干扰技术对犬小孢子菌 PQ-LRP 基因沉默的研究11-30
• 前言11
• 材料与方法11-20
• 1.实验材料11-13
• 2.实验方法13-20
• 2.1 质粒提取、DNA 纯化回收13
• 2.2 总 RNA 提取13-14
• 2.3 RNA 反转录14-15
• 2.4 感受态细胞的制备和转化15
• 2.5 RNA 干扰载体 pCB309-PLULT 的构建15-17
• 2.6 电转感受态的制备及转化17-18
• 2.7 确定潮霉素的筛选浓度、制备转化子并进行基因定量分析18-20
• 结果20-24
• 1. 犬小孢子菌的鉴定20
• 2. RNA 提取20
• 3. RNA 干扰载体 pCB309-PLULT 的构建20-21
• 4．PCB309-PLULT 质粒的农杆菌转化21
• 5. PUC-PLUT 的测序21-23
• 6．确定犬小孢子菌对潮霉素的最佳转化浓度23
• 7.应用 Real Time PCR 方法分析相对表达量23-24
• 讨论24-27
• 结论27-28
• 参考文献28-30
• 第二部分 面部线状皮肤型红斑狼疮 1 例30-32
• 材料30-31
• 讨论31
• 参考文献31-32
• 综述32-39
• 参考文献37-39
• 攻读学位期间发表论文情况39-40
• 致谢40-41

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前9条

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本文编号：270215