TCF-4在人皮肤鳞癌中的作用机制研究

发布时间：2020-06-13 10:55

【摘要】：皮肤癌是异常皮肤细胞增长失控所致,这些细胞由于长期暴露于UV辐射下(阳光或日光浴)而导致基因突变增加。皮肤癌包括基底细胞癌(BCC),皮肤鳞状细胞癌(cSCC)和黑色素瘤。流行病学研究表明,cSCC占全部皮肤癌的20%,在全球的发病率持续上升,每10万人中有15-35人确诊为cSCC,估计每年将以2-4%速度递增,对公众健康和生活构成严重威胁,而cSCC的一个重要特征是具有不良预后的倾向。除紫外线照射的原因外,遗传方面的原因,尤其是紫外线诱导的环丁烯嘧啶二聚体的DNA损伤修复也有助于cSCC的进展。此外,细胞生长、凋亡和侵袭的调控网络同样促发了cSCC的癌变进程。由于cSCC具有强大的侵袭能力,使其比其他几种皮肤癌都更具危险性,因此,更好地了解cSCC对加强预防和治疗研究具有重要意义。T细胞因子4(TCF-4)是T细胞因子/淋巴增强因子(TCF/LEF)家族成员之一。TCF-4蛋白包括四个主要功能域,β-catenin结合区域;高迁移率组蛋白结构域(HMG-box),主要发挥DNA序列的识别功能;Groucho蛋白结合域,负责TCF-4的负反馈作用和一个核定位信号结构域。TCF-4与肿瘤关系密切,已确定TCF-4可激活多种癌症中的Wnt/β-catenin信号通路,包括结直肠癌、胰腺癌、前列腺癌等多种癌症,并且在癌细胞中沉默TCF-4的表达可以有效抑制肿瘤细胞的生长、增殖和侵袭过程,这表明TCF-4具有致癌作用,可以作为癌症治疗的潜在治疗靶点。如前所述,TCF-4在表皮干细胞中表达发挥关键作用,但目前TCF-4在cSCC癌变和发展中的作用和潜在机制仍知之甚少。在本研究中,我们发现TCF-4在cSCC癌组织中表达显著上调,通过构建TCF-4抑制的A431皮肤癌细胞系,利用MTT、Transwell、TUNEL等实验证实了沉默TCF-4后,A431细胞增殖和侵袭受到抑制,同时细胞凋亡程度增加。通过对TCF-4沉默和对照组进行的转录组测序结果显示,147个基因上调(包括113个编码基因和34 lncRNA)和172个基因下调(包括64个编码基因和108 lncRNA),这些差异基因除了和Wnt/β-catenin信号传导途径相关外,还和另外18条调节通路包括类固醇、卟啉、花生四烯酸和视黄醇等新陈代谢途径、血管生成、炎症反应以及细胞粘附等密切相关。此外ChIP-qPCR实验发现,TCF-4干扰引起显著下调的前十个基因启动子上,TCF-4与β-catenin的结合能力显著减弱了,有趣的是在TCF-4未干扰的A431细胞中,ALDH8A1,DRICH1和UGT1A5三个基因仅有TCF-4而没有β-catenin富集,这暗示TCF-4可能通过wnt/β-catenin依赖和独立的方式来调节基因表达。通过本研究,我们试图说明TCF-4在cSCC发生发展过程中通过对多种信号通路特别是在Wnt信号的异常激活中发挥了重要作用,并为cSCC治疗提供了潜在的治疗靶点。
【图文】：

图 1 TCF-4 在 cSCC 组织中表达10 例人 cSCC 及其癌旁组织中 TCF-4（A）和 β-catenin（B）的免疫组化染色结果（20x）及的统计分析。放大图像（100x）中 TCF-4 和 β-catenin 阳性细胞核更为显著。P<0.05 表示有显著。蓝色箭头指示 TCF-4，红色箭头指示 β-catenin。.3 TCF-4 沉默的 cSCC 细胞中差异基因表达为继续研究 TCF-4 促进人皮肤鳞癌细胞增殖、侵袭的分子机制，我们收集了 TCFiRNA_1 处理 48 小时的 A431 细胞进行转录组高通量测序。NC、BL 和 TCF-4 siRNA组 mRNA 转录文库的测序深度分别是 192M，200M 和 162M，通过 HISAT2 软件比到样本基因组定位于 GRCh38。测序结果显示，约有 80%的读取是特异性匹配，而 20读取错误匹配，，此外所有读数中仅有不到 1.5% 匹配到 rRNAs，RNA 文库制备质量高（表 12）。通过 StringTie 量化具有 FPKM 分布的基因表达，并呈现三组中的差

图 2 TCF-4 抑制对 A431 细胞的影响（A）RT-PCR 检测三种不同的 TCF-4 siRNA 分别在 24h、48h、72h 处理后，A431 细胞中 TCF-mRNA 水平的表达情况。（B）Western blot 检测 TCF-4 siRNA_1 分别在 24h、48h、72h 处理后31 细胞中 TCF-4 的蛋白表达情况。（C）MTT 检测 TCF-4 敲低后 A431 细胞的增殖情况。（Dnswell 检测 TCF-4 敲低后 A431 细胞的侵袭情况。（E）TUNEL 实验检测检测 TCF-4 敲低后 A43的凋亡情况。所有数据重复三次，“*”表示相对于对照，p 值小于 0.05。
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.5

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本文编号：2711071