【摘要】：背景:银屑病是皮肤科常见的慢性炎症性疾病,治疗效果不佳,对患者的生活质量造成很大影响。目前普遍认为以T细胞为主的免疫细胞异常激活、皮肤局部角质形成细胞(KC)增殖活跃、分化障碍以及异常免疫活性是银屑病发病的重要环节。银屑病皮损处KC过度增殖、代谢活跃、分化不全的状态与肿瘤细胞在快速增殖过程中表现出活跃的葡萄糖摄取和糖酵解现象(Warburg效应)有许多相似之处,即在银屑病表皮KC也具有和肿瘤细胞类似的将氧化磷酸化转化为糖酵解的代谢重编程过程(即糖代谢重编程,也称糖酵解,将葡萄糖经过一系列酶促反应转化为乳酸)。糖酵解代谢作为能量代谢的重要一环,在调控天然免疫应答,参与炎症性疾病发生与发展中具有重要功能,已经成为代谢与炎症领域新的研究热点。同时,KC可以识别病原微生物分子模式(PAMPs)、危险相关分子模式(DAMPs)刺激物进而激活炎症小体,分泌IL-1β炎症因子,参与免疫炎症应答反应。最新研究表明,NLRP3炎症小体和IL-1β在银屑病病程发展过程中发挥重要调控作用。银屑病皮损处KC活化的NF-κB和炎症小体可造成多种免疫相关蛋白如CCL-20、CXCL-1、CCR6、CXCL-9-11和IL-36产生,进一步诱导炎症应答反应发生。同时,IL-1β炎症因子可以和IL-23相互作用促进Th1和Th17细胞分化和多种炎症因子的产生。并且,糖酵解代谢通路及其终产物乳酸水平在银屑病患者外周显著升高,缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在银屑病皮损表皮高表达,调节KC糖酵解代谢,促进乳酸的形成,为银屑病KC异常增殖提供有利的微环境。同时,糖酵解代谢途径关键限速酶PKM2和终产物乳酸分别调控EIF2AK2和NF-κB信号促进NLRP3炎症小体活化及IL-1β炎症因子分泌,提示糖酵解代谢途径具有调控炎症免疫应答的作用。但角质形成细胞免疫炎症应答在银屑病发病中的作用及机制还有待进一步阐明。CD100属于脑信号蛋白(Semaphorin)家族成员之一,是首个被发现具有免疫调节功能的脑信号蛋白,又称Semaphorin 4D。其亲和力受体PlxnB2主要在上皮细胞和内皮细胞中表达。CD100是一种膜表面蛋白,全长150KD,膜型CD100(mCD100)可被多种蛋白水解酶剪切后从细胞膜表面脱落,形成功能性的可溶型分子(sCD100)。sCD100在多种慢性炎症的血清或组织局部水平升高,并与疾病的严重程度和预后等多种临床指标密切相关。sCD100可促进类风湿关节炎患者PBMC TNF-α和IL-6炎症因子产生。最新研究发现:Semaphorin-Plexin信号激活NF-κB通路,NF-κB信号通路和NLRP3炎症小体之间存在相互作用。并且,HIF-1α在银屑病皮损表皮高表达,调节KC糖酵解代谢,促进乳酸的形成;同时,CD100是HIF-1α的上游调控基因,可能与受体PlxnB2结合后通过该途径促进KC糖酵解代谢。由此我们提出以下研究假说:CD100-PlxnB2促进KC NF-κB信号通路和NLRP3炎症小体活化。并且,CD100-PlxnB2还可通过影响KC糖代谢模式,引起Warburg效应,促进糖酵解产物乳酸产生。一方面,乳酸调控NF-κB信号增加KC IL-1β炎症因子释放;另一方面,PKM2调控EIF2AK2信号促进KC NLRP3炎症小体活化及IL-1β和IL-18炎症因子分泌,影响KC免疫活性,参与银屑病免疫炎症反应。目的:研究CD100及其受体PlxnB2促进KC NLRP3炎症小体活化及调控KC糖酵解代谢参与银屑病炎症的具体机制,为银屑病的治疗提供新的思路。具体的研究目标:1.分析CD100及其受体PlxnB2在银屑病皮损表皮和咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样模型表皮的表达情况;2.研究CD100-PlxnB2促进KC NLRP3炎症小体活化和炎症因子表达的信号转导通路,明确CD100-PlxnB2通过调控炎症小体活化参与银屑病发病的分子机制;3.研究CD100-PlxnB2参与调控KC糖酵解代谢的作用及关键分子机制,阐明CD100-PlxnB2调控KC糖酵解代谢参与银屑病炎症免疫应答的作用机理。方法:1.CD100及其受体PlxnB2在银屑病和IMQ诱导的小鼠银屑病样模型表达分析:收集25例进展期银屑病患者、特应性皮炎患者和健康正常对照的外周血,10例银屑病患者皮损组织、特应性皮炎皮损组织和正常皮肤组织。免疫组化、qRT-PCR和western blots检测银屑病患者皮损表皮CD100及其受体PlxnB2的表达水平;ELISA检测银屑病患者、特应性皮炎患者及健康正常对照血清sCD100的水平。同时,收集10例进展期银屑病患者和健康正常对照的外周血,分离PBMC,流式细胞术检测银屑病患者外周血PBMC中mCD100在不同细胞亚群的表达水平。构建咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样模型和卡泊三醇诱导的小鼠特应性皮炎模型,流式细胞术、平均荧光强度和qRT-PCR检测PlxnB2在银屑病样和特应性皮炎样小鼠模型表皮表达情况。2.CD100调控Rho GTPase信号对KC炎症小体活化的作用及机制:体外培养HaCaT细胞系和原代KC,给予CD100刺激并转染PlxnB2-siRNA干涉片段,qRT-PCR、western blots和ELISA检测NLRP3炎症小体活化和炎症细胞因子、趋化因子的表达及分泌水平;GST pull down检测Rho GTPase活性的表达变化。使用关键通路分子抑制剂,验证CD100诱导KC NLRP3炎症小体活化并产生炎症细胞因子和趋化因子的下游信号通路。3.银屑病糖酵解关键限速酶表达水平:收集10例银屑病患者皮损组织和正常皮肤组织,免疫组化、qRT-PCR和western blots检测银屑病皮损表皮糖酵解关键限速酶的表达水平。4.CD100通过受体PlxnB2调控Rho GTPase信号参与KC糖酵解代谢机制:体外培养原代KC,给予CD100刺激并转染PlxnB2-siRNA干涉片段,qRT-PCR和western blots检测糖酵解关键限速酶的表达水平;分光光度计检测葡萄糖摄取、乳酸产生和乳酸脱氢酶活性水平;pH计检测细胞处理后培养基pH的变化情况。体外培养原代KC,给予CD100刺激并加入Rho GTPase通路抑制剂,qRT-PCR和western blots检测角质形成细胞糖酵解关键限速酶的表达水平。5.乳酸-NF-κB和PKM2-EIF2AK2信号参与银屑病炎症机制:体外培养原代KC,使用NF-κB信号通路特异性抑制剂并加入乳酸,western blots和ELISA检测NF-κB信号通路活化和IL-1β炎症因子分泌水平;并且,使用PKM2特异性抑制剂并加入CD100刺激,qRT-PCR和western blots检测EIF2AK2磷酸化和NLRP3炎症小体活化水平。结果:1.CD100及其受体PlxnB2在银屑病和IMQ诱导的小鼠银屑病样模型高表达:ELISA结果显示,与特应性皮炎患者和健康正常对照相比,sCD100水平在银屑病患者血清中高表达,并与银屑病皮损面积和严重程度指数PASI评分呈正相关;免疫组化、qRT-PCR和western blots结果显示,与特应性皮炎皮损组织和正常皮肤组织相比,CD100及其受体PlxnB2在银屑病皮损表皮表达增高,且主要表达于表皮角质形成细胞。流式细胞术结果显示,mCD100在银屑病外周血PBMC的T细胞、单核细胞和血小板表达显著降低。流式细胞术和qRT-PCR结果表明,PlxnB2在咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样模型表皮中的表达显著高于卡泊三醇诱导的小鼠特应性皮炎样模型和野生型小鼠,以上结果提示,CD100及其受体PlxnB2在银屑病患者和咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样模型中均显著高表达。2.CD100通过受体PlxnB2调控RhoA和Rac1信号促进KC NLRP3炎症小体活化和炎症细胞因子、趋化因子的表达及分泌:qRT-PCR、western blots和ELISA结果表明,sCD100刺激HaCaT细胞系和原代KC后,NLRP3炎症小体活化和炎症细胞因子及趋化因子的表达和分泌水平明显升高;使用PlxnB2-siRNA干涉片段,可明显抑制NLRP3炎症小体活化和炎症细胞因子及趋化因子的表达和分泌。qRT-PCR、western blots和GST pull down结果显示,sCD100刺激HaCaT细胞系和原代KC后,RhoA和Rac1活性明显升高;使用RhoA和Rac1特异性抑制剂,可明显抑制NF-κB信号通路和NLRP3炎症小体活化,以上结果提示,CD100通过受体PlxnB2调控RhoA和Rac1信号促进NLRP3炎症小体活化和炎症细胞因子及趋化因子的表达和分泌。3.银屑病糖酵解代谢关键限速酶高表达:免疫组化、qRT-PCR和western blots结果显示,糖酵解途径关键限速酶PKM2、HK2和PFK1在银屑病皮损表皮高表达,提示KC糖酵解代谢参与银屑病发病。4.CD100通过受体PlxnB2调控Rho GTPase信号促进KC糖酵解代谢:qRT-PCR、western blots、分光光度计结果表明,CD100通过受体PlxnB2促进KC糖酵解代谢途径关键限速酶表达;且促进葡萄糖摄取、乳酸产生和乳酸脱氢酶活性,并显著降低培养液pH值。qRT-PCR和western blots结果表明,使用RhoA和Rac1特异性抑制剂,可明显抑制KC糖酵解代谢关键限速酶PKM2和HK2表达,以上结果提示CD100通过受体PlxnB2调控Rho GTPase信号促进KC糖酵解代谢。5.PKM2-EIF2AK2和乳酸-NF-κB信号是KC糖酵解代谢参与银屑病炎症的关键机制:Western blots和ELISA结果显示,使用NF-κB信号通路特异性抑制剂,可明显抑制乳酸对KC IL-1β炎症因子分泌;并且,使用PKM2特异性抑制剂,可抑制KC EIF2AK2磷酸化和NLRP3炎症小体活化,提示PKM2-EIF2AK2和乳酸-NF-κB信号是KC糖酵解代谢参与银屑病炎症的关键机制。结论:银屑病皮损中高表达的CD100-PlxnB2,促进KC炎症细胞因子和趋化因子表达及NLRP3炎症小体活化。并且,CD100-PlxnB2还可通过Rho GTPase-HIF1α信号影响KC糖代谢模式,引起Warburg效应,促进糖酵解产物乳酸产生;一方面,乳酸调控NF-κB信号增加KC IL-1β炎症因子释放;另一方面,PKM2调控EIF2AK2信号促进KC NLRP3炎症小体活化及IL-1β炎症因子分泌,影响KC免疫活性,参与银屑病免疫炎症反应。我们的研究证实CD100-PlxnB2-KC糖酵解代谢-NLRP3炎症小体轴参与银屑病免疫炎症反应,不仅揭示了KC糖酵解代谢参与银屑病炎症的具体机制,也为银屑病的治疗提供了新的思路。
【图文】：
文献回顾病发病机制屑病概述及病理表现屑病是临床上常见的慢性炎症性皮肤病，影响全球 2-3%人口，其发难且易复发，严重影响患者的生活质量[1]。根据临床表现和严重程度常型银屑病、关节病型银屑病、脓疱型银屑病和红皮病型银屑病[2]。屑病是临床上最为常见的类型，，其症状表现为境界清楚的红斑和鳞屑肘关节伸侧和头部[3]。以往研究发现，银屑病患者罹患心血管疾病和率要显著高于健康对照，危害很大[4]。银屑病发病机制十分复杂，环素，固有免疫和适应性免疫共同参与并发挥作用，介导银屑病发病[5
图 3 膜型 CD100 剪切机制[107]4 CD100 在多种疾病发病中的作用4.1 CD100 与神经退行性疾病CD100 在神经免疫应答中发挥重要作用。抑制 CD100 信号能降低中枢神经系的炎症，增加神经元生长和促进少突胶质细胞的成熟，是治疗神经退行性疾病潜的治疗靶标[118]。多发性硬化症（MS）和自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是中枢神经统常见的慢性神经炎症性疾病。MS 以免疫细胞浸润、血脑屏障和局部髓鞘破坏和进的神经元退化为主要特点。EAE 是延迟的过敏性疾病，并伴有白质抗原的产生在多发性硬化症中，mCD100 水平在 T 细胞表达上调，并在活化的 T 细胞中大量落成 sCD100。而在 B 细胞中，CD72 表达明显降低[119]。在多发性硬化症外周血mCD100 高表达于 CD8+T 细胞和 CD19+B 细胞中，血清 sCD100 水平也明显升高
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R758.63
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