毛囊真皮细胞在真皮替代物中诱导外根鞘细胞形成毛囊样结构的研究

发布时间：2020-06-14 08:34

【摘要】： 成熟毛囊由属于上皮部分的外根鞘与内根鞘和属于真皮部分的毛乳头与真皮鞘组成。毛囊是角质形成细胞、黑素细胞和间质真皮细胞的干细胞库，已成为研究成体干细胞增生、迁移和分化、真表皮细胞间相互作用以及组织器官发育与再生过程的重要对象和工具。其中毛囊重建的研究对美容、药学、创伤愈合都有着重要影响。缺乏皮肤附属器和疤痕形成是目前组织工程皮肤替代物的共同缺陷。毛囊可能在提高皮肤创伤愈合速度、减少皮肤瘢痕形成、提高伤口愈合质量上起着重要作用。毛囊真皮细胞在诱导表皮生长和真皮最后结构中有着重要的发育功能。毛囊隆突上皮细胞和毛囊真皮细胞的干细胞特性使毛囊来源的组织工程皮肤替代物有可能产生皮肤附属器。因此，用毛囊细胞来构建皮肤替代物以产生皮肤附属器的研究成为热点。学者们构建了细胞移植、细胞注射、条件器官型移植等多种毛囊重建模型，并成功地在特定部位(如肾包膜下)诱导产生了毛囊、毛发等皮肤附属器。但这些研究模型缺乏支架，诱导环境不是正常毛囊的生长环境，并不实用。随着组织工程技术的发展，以胶原凝胶为支架，更接近正常毛囊生长环境的皮肤替代物毛囊诱导模型应运而生。但单纯以各种毛囊来源细胞构建的双层皮肤替代物体外均未能诱导出毛囊样结构。移植后仅Gharzi的大鼠研究取得突破，成功诱导出毛囊和毛发。Limat和Havlickova以Ⅰ型胶原成纤维细胞和／或毛乳头细胞凝胶为基础，在富含基底膜成分的细胞外基质Matrigel中，用毛乳头细胞和外根鞘细胞在体外诱导出囊肿样或梭形细胞团毛囊样结构，并对诱导产物进行了细胞增生、分化及培养基影响因素的研究。毛囊形态发生的基本过程是：来源于真皮的起始信号启动局部表皮形成基板，基板发出的表皮信号反过来作用于间质，形成真皮细胞凝集团，在真皮细胞凝集团的信号作用下基板细胞增生形成毛囊胚芽，并继续向真皮中生长，包绕真皮细胞凝集团，使之发育成毛乳头，而上皮细胞发育成同心圆排列的各上皮细胞系，，形成毛囊。这些信号中，β-catenin起着非常关键的毛囊发育起始诱导作用，而位于其下游的分泌型蛋白Sonic hedgehog(Shh)在表皮-间质信号中起主要作用，调节毛囊表皮增生和进一步向间质生长及毛乳头形成。研究诱导产物的β-catenin和Shh表达，可以初步把握Wnt信号表达与诱导结构形成的关系。本实验对文献报道的繁琐毛囊真皮成分细胞分离方法进行了改进；对用毛乳头细胞、真皮鞘细胞和外根鞘细胞构建的双层皮肤替代物产生毛囊的可能性进行了探讨；并对毛乳头细胞、真皮鞘细胞复方壳多糖真皮基质凝胶基础上，真皮鞘细胞与外根鞘细胞的混合Matrigel凝胶(双层真皮替代物)诱导毛囊形成情况及裸鼠移植后的情况进行了组织学、免疫组化研究，并以包皮细胞来源的双层皮肤替代物、正常人毛囊、裸鼠皮肤(毛囊)为对照，进行了β-catenin、Shh免疫印迹蛋白表达分析。本实验的主要研究结果如下：(1)真表皮交界处横断头皮标本，拔出完整下段毛囊，解剖显微镜下用两支带针头的1mL塑料注射器游离毛乳头，移液枪捕捉，胶原酶消化的方法可快速获得纯化毛乳头细胞。(2)碱性磷酸酶染色可鉴定低代毛乳头细胞和真皮鞘细胞。(3)毛囊来源细胞所构建的皮肤角化突出，表皮细胞排列紧密，但体外及常规、皮下移植后均无明确毛囊样结构形成，与已报道的大多数研究结果一致。(4)体外，真皮鞘细胞与外根鞘细胞的混合Matrigel凝胶在毛乳头细胞、真皮鞘细胞复方壳多糖真皮替代物上分别诱导出平均直径47±5gm和38±2μm细胞团或囊肿样器官型毛囊样结构。裸鼠皮下埋植后，中心完全角化的囊肿样结构突出，平均直径分别为133±12μm和131±9μm，可见典型毛球样结构，并见诱导的器官型毛囊样结构向真皮替代物内生长的现象。PAS染色，移植后的结构有基底膜样物质包绕，结构周边有PAS染色阳性细胞。AS染色，诱导结构周围有蓝色结缔组织鞘样结构形成。体外和移植标本均表达CK6、CK14、AE1、AE3，角蛋白表型与正常毛囊一致。(5)体外及移植后标本均表达β-catenin。免疫印迹实验，DPC及DSC双层真皮替代物诱导系统移植前后β-catenin和Shh均有较强表达，移植后标本比移植前强，但弱于头皮标本。本研究建立了毛囊真皮成分细胞的快速高效纯化培养方法；构建了完全由人毛囊细胞来源的双层皮肤替代物，对带皮肤附属器的双层人工皮肤的研究进行了初步的探索，提出有多向分化潜能的上皮干细胞与有诱导能力的毛囊真皮细胞结合是组织工程皮肤能产生皮肤附属器的方案；在真皮替代物中首次成功构建了DSC与ORSC的体外器官型毛囊诱导模型。裸鼠移植后，诱导形成了毛球、基底膜和结缔组织鞘样结构。免疫组化研究证实诱导结构向毛囊分化。免疫印迹和免疫组化研究初步说明β-catenin表达过高可能是形成囊肿样结构的原因。本研究进一步说明了毛囊诱导环境重建和毛囊发育信号调控在组织工程重建毛囊中的重要性，也证实了真皮鞘细胞也有毛乳头细胞类似的诱导毛囊形成能力。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R751
【图文】：

直方图,免疫印迹,直方图,照片

第三军医大学博士学位论文较强表达，其中头皮标本最强，移植后标本比移植前强。相对光密度值对比见图4一l。三、ShhW七 stemblot结果兔抗Shh多克隆抗体(SC一9024)检测45kDa的人 Shh41一200氨基酸。包皮细胞来源皮肤替代物(照片4一7和照片4一9，Lanel)Shh蛋白表达阴性。裸鼠皮肤(照片4一7和照片4一9，LaneZ)有微弱表达。头皮标本(照片4一7和照片4一9，Lane3)、DPC真皮替代物诱导系统移植前(照片4一7，Lane4)后(照片4一7，Lanes)、DSC真皮替代物诱导系统移植前(照片4一9，Lane4)后(照片4一9，Lanes)均有较强表达

【参考文献】