微小RNA-let-7a对黑素瘤细胞系生物学行为的影响及其作用机制研究

发布时间：2020-06-15 11:23

【摘要】： 皮肤恶性黑素瘤起源于黑素细胞,致死率高,转移后无有效疗法。miRNAs是一类新发现的在肿瘤中发挥癌基因或抑癌基因样作用的小分子RNA。本课题研究miRNA-let-7a在皮肤黑素瘤发病机制中的作用,寻找皮肤黑素瘤新的早期诊断标记和治疗靶点。目的研究miRNA-let-7a在福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的皮肤黑素瘤组织和黑素瘤细胞系A375中的表达,探讨1niRNA-let-7a对黑素瘤细胞系A375细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制；研究BRAF蛋白在黑素瘤细胞系A375和原代黑素细胞的表达差异,探索miRNA-let-7a对黑素瘤发病中关键蛋白BRAF的作用。方法选取福尔马林固定石蜡包埋的黑素瘤组织13例,先天性色素痣组织10例,培养黑素瘤细胞系A375和原代黑素细胞,分别采用High Pure miRNA Isolation试剂盒和RNAiso Plus抽提miRNA及总RNA,逆转录为cDNA,用Taqman MGB探针和相应的引物,在ABI Prism 7500荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR。对SDS软件生成的数值进行计算和统计学分析。蛋白质印迹法检测BRAF蛋白在黑素瘤细胞系A375及原代黑素细胞的表达差异。应用cy3标记的siRNA转染A375细胞,荧光显微镜下观察转染效率。利用hsa-let-7a的模拟物及其阴性对照分别瞬时转染黑素瘤细胞系A375,CCK-8实验计算转染后两组细胞增殖的差异,流式细胞术检测两组细胞凋亡的不同,免疫印迹实验分析两组细胞Caspase-3((半胱天冬酶-3)蛋白和BRAF蛋白的表达差异。结果从福尔马林固定石蜡包埋的组织中成功抽提出miRNA,实时荧光定量PCR结果显示miRNA-let-7a在FFPE黑素瘤组织中的表达明显低于色素痣组织(P0.05),在黑素瘤细胞系A375中的表达明显低于原代黑素细胞。荧光显微镜下观察可见siRNA的转染效率约80-90%。与阴性对照相比,50nM的hsa-let-7a模拟物转染A375细胞后,1niRNA-let-7a的表达升高2.067倍。采用miRNA-let-7a的模拟物转染后,与阴性对照相比,A375细胞增殖受抑,细胞凋亡增加(P0.05)。与黑素细胞相比,BRAF蛋白在黑素瘤A375细胞系表达升高；与阴性对照相比,miRNA let-7a的模拟物转染A375细胞系后,caspase-3蛋白和BRAF蛋白表达均下降。结论FFPE组织适合用来研究miRNA在黑素瘤中的表达,miRNA-let-7a在黑素瘤中表达下调,过表达miRNA-let-7a可抑制黑素瘤细胞系A375细胞的增殖并促进其凋亡,促进凋亡的机制可能与miRNA-let-7a下调caspase-3有关。黑素瘤发病中的关键蛋白BRAF在黑素瘤细胞系A375中的表达明显高于原代黑素细胞,miRNA-let-7a可下调BRAF蛋白的表达。总之,miRNA-let-7a可能在黑素瘤的发病中发挥抑癌基因的作用,有望成为黑素瘤早期诊断指标和治疗靶点。
【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R739.5
【图文】：

关联图,靶基因,抑癌基因,肿瘤抑制基因

图1miRNA与癌症关联图a正常组织中miRNA下调相应的靶基因的表达发挥生物学作用bm1RNA的靶基因是原癌基因，发挥肿瘤抑制基因样作用cmiRNA的靶基因是抑癌基因，发挥癌基因样作用。巨前己发现数种miRNA在黑素瘤细胞表达异常，其中miRNA一221和miRNA一222在黑素瘤中表达升高，可以通过下调p27KIPI/CDKNIB和c一心T受体两条通路来促进黑素细胞的恶性转化，在黑素瘤中发挥癌基因样作用卜61。而miRNA一137、一34a、一199a和let一7家族成员let一7a、let一7b等，分别下调相应的靶基因，在黑素瘤中发挥抑癌基因样的作用卜12]。国内仅王众等研究了miRNA一21在黑素瘤细胞系的表达及其对黑素瘤细胞系活性的影响l’31。miRNA对黑素瘤相关基因的表达调控研究，不仅指向早期黑素瘤发生的新的调节机制，而且为将来靶向治疗开辟了道路。鉴于miRNA的特性，通过调节其表达控制肿瘤的生物学行为是目前治疗肿瘤

实时荧光定量PCR,探针法,逆转录

由于miRNA分子量很小，本实验的试剂盒中含有一个带茎环的引物，这样逆转录后cDNA的链变长，以利后续的定量PCR实验(见图2)。m唇RNA RTPrimer SSStePI:::SSStem·IooPRTTT右DNA TaqManPro加图2采用 TaqManMGB探针法的而RNA的实时荧光定量PCR实验包括两部，茎环逆转录和实时荧光定量PCR

【参考文献】