急性炎症对黑色素瘤生长和血管生长的影响及机制的实验研究

发布时间：2020-06-17 14:30

【摘要】： 1863年Virchow提出，肿瘤的形成源自慢性炎症，从此展开了对肿瘤与炎症之间关系的研究。目前较为明确的观点认为，相当一部分肿瘤与慢性炎症密切相关，但当肿瘤和炎症共存时，二者之间的相互作用和影响则少见报道。炎症的过程涉及了肉芽组织的形成，即成纤维细胞的增殖和间质细胞的构架、血管生成以及炎症细胞的浸润，这些都与肿瘤的形成过程颇为相似。炎症的过程是局限且受机体控制的生物学过程，而肿瘤则不然，炎症的受控性与肿瘤的失控性形成了鲜明的对比。本研究利用黑色素瘤这一常见的恶性肿瘤为模型，建立了同时存在手术切口的荷瘤小鼠，通过观察急性炎症对肿瘤体积、微血管密度(Microvessel density，MVD)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growthfactor，VEGF)-a、基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPs)家族中的MMP-2和MMP-9的表达及其活性，及体内外实验动态观察转化生长因子(Transforming growth factor，TGF)-β和干扰素(Interferon，IFN)-γ对B16F10细胞的影响，来评价当机体同时存在急性炎症(手术伤口)和肿瘤时，急性炎症对黑色素瘤的影响，并对其相关分子机制进行初步探讨。主要研究内容如下：第一部分：小鼠黑色素瘤急性炎症模型的建立本研究选择了黑色素瘤，这一高度恶性且早期血行转移的肿瘤作为研究模型，依靠C57BL小鼠和B16F10黑色素瘤细胞来构建急性炎症-肿瘤的动物模型，待黑色素瘤长至500 mm~3左右时，建立不同类型的急性炎症-黑色素瘤模型：A组为单纯创伤-黑色素瘤模型，B组为重复扩创-黑色素瘤模型，C组为创伤/化脓菌-黑色素瘤模型，D组为创伤/冰乙酸-黑色素瘤模型，E组为单纯肿瘤模型(对照组)。每日观察肿瘤生长及伤口愈合情况、绘制肿瘤生长曲线，比较不同急性炎症-肿瘤模型的效果。实验结果表明：在建立急性炎症模型以前，对照组与实验组肿瘤体积集中在450-550 mm~3之间，在伤口处施加重复扩创、金葡菌和冰乙酸三种不同干扰后，肿瘤生长出现了不同趋势，A组与E组肿瘤生长比较接近，其他实验组肿瘤生长速度趋缓，体积均小于对照组，这说明急性炎症没达到一定的强度和时间，对肿瘤生长无影响，当达到一定的强度并持续一定时间，可以抑制肿瘤的生长。统计分析证实，B、C、D三种手段均可抑制肿瘤的生长(P＜0．05)，且三者对肿瘤生长抑制的程度没有区别(P＞0．05)。三种建模的方式均可达到持续炎症刺激的效果，但创面和其他情况各不相同：B组小鼠创面干净，结痂和渗出均不明显，组织成分新老交替，但需每日麻醉小鼠后扩创，操作复杂；C组小鼠创面有脓痂覆盖，建模操作简便，但小鼠有罹患败血症的危险，且由于金葡菌感染力强，要求单独饲养；D组小鼠的创面较C组干净，创口处组织成分较B组均一，但冰乙酸具有腐蚀能力，建模过程中易损伤大中型血管及其他敏感部位。根据上述实验结果，重复扩创模型可以尽量避免外源因素的干扰，并且结果稳定可靠，本研究选用重复扩创-黑色素瘤模型作为下一步实验的动物模型。第二部分：急性炎症对黑色素瘤体积及血管生成的影响肿瘤血管生成是肿瘤细胞、血管内皮细胞与其微环境相互影响的复杂的过程，多种活性物质可调节肿瘤血管的生成。炎症过程中产生的多种细胞因子也可调控内皮细胞的激活、增殖、迁移、塑形和凋亡，从而在血管生成过程发挥重要作用。根据第一部分实验结果，选择重复扩创-黑色素瘤模型为本研究的急性炎症荷瘤鼠模型。HE染色检测实验组和对照组肿瘤MVD，免疫组织化学方法检测肿瘤组织VEGF表达，探讨急性炎症对黑色素瘤组织血管生成的影响。实验将小鼠分为对照组与实验组。建模后隔日分别测量对照组和实验组的肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，内眦取血。建立急性炎症模型后第7和11天处死动物，分离肿瘤组织，福尔马林固定并制备蜡块。实验结果表明：1．急性炎症对肿瘤的生长呈现了先抑制后失抑制的表象，即在造模后第7天之内表现为急性炎症抑制肿瘤的生长(早期抑制时相)，而第7天之后，这种抑制作用减弱，至第11天，实验组的肿瘤体积恢复到与对照组相同水平，差异无统计学意义(P＞0．05，晚期失抑制时相)。2．抑制时相期肿瘤组织的MVD计数对照组高于实验组，差异有统计学意义(P＜0．05)。3．抑制时相期肿瘤免疫组织化学染色VEGF阳性表达率，对照组显著高于实验组，差异有统计学意义(P＜0．05)。本研究所建立的模型是通过模拟急性炎症的病理生理过程来观察其直接和间接对肿瘤组织的影响作用，特别关注急性炎症或伤口修复过程中的“调控性”因素对肿瘤组织生长和血管生成的影响。这种影响作用主要体现为先抑制后失抑制的过程，其抑制作用不但与炎症因子的直接刺激有关，也可能与某些炎症灶释放入血的抑制因子有关，失抑制则可能与炎症晚期分泌某种因子的拮抗作用有关。第三部分：急性炎症对黑色素瘤基质金属蛋白酶表达及活性的影响研究发现，肿瘤组织决不是癌细胞简单相加的总和，肿瘤细胞与间质细胞有着密切的协作，这些细胞包括成纤维细胞、炎性免疫细胞比如巨噬细胞、平滑肌细胞以及血管内皮细胞，这些细胞通过细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)相互联结共同构成肿瘤间质成分。肿瘤间质成分对肿瘤细胞本身的生长和迁移都产生重要的影响。基质金属蛋白酶家族在肿瘤及其微环境中参与降解和重塑ECM，对肿瘤的生长、侵袭、转移具有重要的作用，同时也与急性炎症创伤愈合肉芽组织形成密切相关。MMP-2与MMP-9是MMPs的重要成员，在肿瘤微循环和创伤愈合过程中具有重要作用。本部分研究利用免疫组织化学染色观察肿瘤组织MMP-2和MMP-9的表达情况，利用明胶酶谱法定量分析肿瘤组织MMP-2和MMP-9的活性来评价当机体同时存在急性炎症和肿瘤时，急性炎症对肿瘤的MMPs表达与活性的影响。实验结果表明：在第7天时，MMP-2在实验组的表达明显小于对照组，平均阳性细胞率约为对照组的20％(P＜0．05)，而到第11天后该差别减小而无统计学意义(P＞0．05)。实验组与对照组中MMP-9的表达在第7天和11天差异均具有统计学意义(P＜0．05)。急性炎症对MMP-2，MMP-9的活性的影响，在第7天时对照组肿瘤组织内MMP-2和MMP-9酶活性均高于实验组(P＜0．05)；而在第11天时该差别消失(P＞0．05)，其MMPs活性变化趋势与其表达变化趋势相符。由此可见，急性炎症可能通过某种途径影响了肿瘤细胞的MMP-2和MMP-9的表达量和活性，这种影响作用也呈现为早期时相的抑制和晚期时相的失抑制，与本研究第二部分对于肿瘤体积的观察结果相吻合，但为何晚期出现失抑制现象有待于进一步研究。第四部分：IFN-γ和TGF-β对黑色素瘤细胞增殖、迁移和侵袭作用影响的研究急性炎症的过程涉及到早期的炎症因子释放和晚期的肉芽组织修复两个阶段，而本实验所制造的伤口模型由于重复扩创，充当了早期炎症因子释放这个阶段。该阶段涉及了多种炎症因子和炎细胞浸润，炎症组织局部表现为炎细胞浸润，炎细胞浸润主要为粒细胞系统，而影响肿瘤的则可能是炎症灶释放的炎症因子通过血液循环间接干扰肿瘤本身。为了进一步证实炎症局部释放的炎症因子对肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响，本研究通过第二部分研究所获得的血清对细胞因子进行了分析和筛选，发现IFN-γ和TGF-β具有一定的动态变化意义，进而选择C57BL小鼠来源B16F10细胞系进行体外培养，通过施加细胞因子IFN-γ和TGF-β，观察两者对B16F10细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响，自小鼠尾静脉注入IFN-γ，观察其对肿瘤生长的影响。磺酰罗丹明(Sulforhodamine B，SRB)实验结果表明：TGF-β干预组肿瘤细胞存活率高于对照组，差异具有统计学意义(P＜0．05)；IFN-γ干预组肿瘤细胞存活率低于对照组，差异具有统计学意义(P＜0．05)；同时给予IFN-γ和TGF-β干预时，肿瘤细胞存活率明显低于对照组，差异具有统计学意义(P＜0．05)。给予不同细胞因子处理时，随细胞存活率的变化，肿瘤细胞表现为不同的形态，说明IFN-γ可抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，而TGF-β则可拮抗IFN-γ的这种作用，使肿瘤细胞重获并增强其增殖、迁移和侵袭的能力。自小鼠尾静脉注入IFN-γ(注射组)，生长曲线表现为早期抑制时相和晚期失抑制时相。明胶酶谱分析表明IFN-γ降低黑色素瘤MMPs活性，TGF-β升高MMPs活性，二者存在拮抗作用。该实验揭示了肿瘤细胞分泌TGF-β对抗IFN-γ这一生物学现象，解释了急性炎症对肿瘤影响作用呈现为早期抑制和晚期失抑制的可能机制，提出IFN-γ/TGF-β的动态变化可能在急性炎症对肿瘤生长影响的过程中发挥重要作用。综上所述，本研究通过建立急性炎症荷瘤鼠动物模型，应用免疫组化染色、明胶酶谱分析及体外细胞培养等技术，观察急性炎症对肿瘤体积、MVD、VEGF-a表达、MMP-2和MMP-9表达及活性的影响，并通过体内外实验观察TGF-β和IFN-γ的动态变化对肿瘤的影响。主要结论如下： 1．建立单纯创伤、创伤+化脓菌、创伤+冰乙酸和重复扩创与荷瘤鼠四种急性炎症-肿瘤复合动物模型。结果表明：单纯创伤-黑色素瘤模型对肿瘤生长无影响，后三者均可抑制肿瘤生长、且对肿瘤生长抑制程度相同，说明急性炎症未达到一定的强度和时间对肿瘤生长无影响，当达到一定的强度并持续一定时间时，可以抑制肿瘤的生长。 2．三种有效抑制肿瘤生长的动物模型各有所长，应结合实际条件，遵循科学合理、方便可行的原则进行选择。本研究选择重复扩创-黑色素瘤模型作为本研究动物模型。 3．急性炎症时实验组肿瘤体积小于对照组，肿瘤组织中VEGF-a表达减少，MVD降低，说明急性炎症对肿瘤组织的影响主要体现为抑制，包括抑制肿瘤生长和抑制血管生成。 4．通过对肿瘤组织的免疫组织化学染色观察和明胶酶谱分析表明，急性炎症抑制肿瘤组织中MMP-2、MMP-9的表达与活性，从而抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长。 5．观察细胞因子IFN-γ、TGF-β对炎症-肿瘤模型的动态影响和对体外培养B16F10细胞影响的结果表明：IFN-γ可抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，而TGF-β则可对抗IFN-γ的作用，使肿瘤细胞重获生长和侵袭能力，增强肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，这种炎性因子对肿瘤细胞生物学特性的正性与负性影响的结果，可解释前期实验观察到的急性炎症对肿瘤生长前期抑制和后期失抑制的现象。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R739.5
【图文】：

创伤愈合,血管生成,肿瘤血管生成

MMPs、勃附分子家族以及癌基因和抑癌基因等。三、炎症与肿瘤血管生成过程的相关因子及研究指标的选择炎症细胞成分与肿瘤间质细胞成分有很多相似之处(见图1)，一些参与炎症过程的细胞及其因子也参与肿瘤血管生成的过程，例如:盛盛上”钻‘“_夕”奥鹊矛鞍鹅蕾.甲呼血”~蛋白。。母母中”“0‘，“甲_‘耽絮霭毖r‘瞥‘”与细“子子qqq巨鹅.库快细.弓尹成纤维，.与纤维期姚卿移行上及， ...图1创伤愈合血管生成与肿瘤血管生成比较a)为创伤愈合血管生成，b)为肿瘤血管生成

曲线,实验组,对照组,黑色素瘤

黑色素瘤动物模型，在注入B16单细胞悬液大约7一ro天后可触及肿物，待肿瘤生长至500~3时入组构建重复扩创一黑色素瘤动物模型。随后第1、3、5、7、9、n天分别测量对照组和实验组的肿瘤体积，并绘制肿瘤生长曲线(见图4)。结果发现，实验组肿瘤体积在5天和7天两个时间点明显小于对照组，结果具有统计学意义(P=0.015、P二0.000)，第7天时肿瘤体积在实验组和对照组的差

【引证文献】