天津市耐药沙眼衣原体野生株的细胞学及基因学研究

发布时间：2020-06-17 10:11

【摘要】：近年来，性传播疾病的发病率在全世界迅猛增加，已成为严重危害人类健康的公共卫生问题。非淋球菌性尿道炎(non-gonococcal urethritis，NGU)的发病率在西方国家已超过淋病，居性传播疾病的首位，我国的病例亦日益增多，成为最常见的性传播疾病之一。在NGU中，40％～50％是由沙眼衣原体(chlamydia trachomatis，C．t)感染所致，泌尿生殖道的C．t感染可引起多种疾病，并可导致严重的并发症和后遗症，因此及时有效地控制C．t感染的传播是非常必要的。近年来新型抗生素的出现为C．t感染的治疗提供了很多的选择，但同时，有关C．t抗生素耐药的报告日渐增多，临床上C．t的生殖道感染复发病例亦屡见不鲜，这个问题困扰着临床医生。在国外已有许多学者开始研究沙眼衣原体的耐药问题，其研究深度已经到达基因水平，而国内目前尚无相关报道。了解泌尿生殖道C．t对常用抗菌药物的耐药情况可作为临床制定合理治疗方案的重要依据。为此，我们通过沙眼衣原体细胞培养，从天津市性病研究所就诊的病人泌尿生殖道分离出30株C．t野生菌株，并运用碘液染色计数包涵体的方法检测了这些野生株在体外对3种常用的抗菌药物四环素、阿奇霉素(商品名希舒美)、盐酸莫西沙星(商品名拜复乐)的敏感性。对发现的耐药菌株以及部分敏感菌株进行耐药基因的聚合酶链式反应(PCR)扩增，以期能从基因角度来探讨其可能的耐药机制。我们采用McCoy细胞培养的方法分离制备待检测的沙眼衣原体野生株，将在无抗菌药营养液中传代数次的McCoy细胞接种于24孔板，5％CO_2、37℃条件下孵育24h，然后加入待测的临床标本，离心、去上清液，同前条件孵育48h后，镜下观察结果。阳性标本传代至90％以上的细胞形成包涵体并收集，放于-80℃保存备用。先确定能引起90％以上细胞感染的C．t接种量，以硕士研究生论文中文摘要文献推荐浓度为中间浓度，将四环素、阿奇霉素及盐酸莫西沙星分别配置成六个等比稀释浓度，加入药物后以沙眼衣原体在细胞内不生长的最低浓度为最低抑菌浓度(MIC)。发现耐药菌株后，根据Genebank中的四环素耐药决定子 (t以M)的基因序列设计引物，抽提出耐药菌株的质粒DNA并采用PCR方法对抽提出的DNA进行了扩增。在敏感菌株中我们随机抽取了4份标本用同样的方法也进行了扩增。对于四环素敏感性结果显示:30份临床野生分离株中，呱C成0.313mg/1 的有3株，MIC在0.313一0.625m8/L之间的有3株，呱C在0.625一1 .25mgl 之间的有8株，Mlc在1.25一2.smg/L之间的有10株，MIC在2.5一sm目L 之间的有4株，在5一10mg飞之间的有2株;对阿奇霉素的敏感性结果显示加nC。.125mg/1的有0株，在0.125一0.ZSm创毛之间的有17株，MIC 在。.25一。.smg飞之间的为13株，MIC0 .sm目L的有o株。对莫西沙星的敏感性显示MIC均集中在0.06一0.12m叭之间。显微镜下观察发现耐药菌株的包涵体形态学发生改变，失去了正常的椭圆形，并且数量较少。用tetM 的引物对耐四环素的两株野生株的质粒DNA进行PCR扩增，两株均在琼脂箱毅敌电泳上于约300个bp处出现一条明亮的条带;另4例敏感菌株扩增结果均为阴性。上述结果从试验的观点证明了在天津市临床上已出现了对四环素耐药的沙眼衣原体野生株，临床上经足量、足疗程四环素类药物治疗难以阴转的病例，可能已出现耐药。耐四环素的菌株对阿奇霉素和盐酸莫西沙星是敏感的。我们在抽提的耐药菌株的质粒DNA上扩增出了tetM基因片段，因此考虑该耐药株的发生机制可能系由质粒介导的。但是仍需要进一步的实验来加以证实。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R759

【参考文献】