大麻素Ⅱ型受体激动剂在恶性黑素瘤中血管生成作用机制的研究

发布时间：2020-06-18 13:17

【摘要】： 研究背景与目的 恶性黑素瘤(malignant melanoma,MM)是一种高度恶性的肿瘤,发生隐蔽,易发生血管和淋巴结转移,发展迅速、预后差、死亡率高。删的生长和转移依赖于肿瘤内的血管生成(angiogenesis),而血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)在肿瘤血管生成机制中处于核心地位。研究表明MM血管生成十分活跃,VEGF作为最重要的促血管生成因子而逐渐成为研究热点。 已知的大麻素受体(cannabinoid receptor CB-R)分为Ⅰ型大麻素受体(cannabinoid receptor 1,CB-R1)和Ⅱ型大麻素受体(cannabinoid receptor 2,CB-R2),均为G-蛋白偶联受体(G-protein coupled receptors,GPCRs),GPCRs在肿瘤的生长和血管生成中具有重要作用。研究表明CB-R2具有抗炎症、抗增殖、抗肿瘤等作用,CB-R2激动剂体外试验可诱导细胞凋亡,体内试验可抑制肿瘤的生长而无明显的副反应。本课题组前期研究发现,CB-R2受体在MM组织中呈高表达,但对其在删中是否参予迁移、侵袭和血管生成的作用机制尚不完全明确。如能证实CB-R2激动剂具有抗血管生成和抑制肿瘤生长的功能,其可能成为治疗MM新的抗血管生成靶点药物。本课题的目的是通过体外和体内实验模型,拟证明CB-R2参与MM的发病过程,探讨CB-R2受体激动剂JWH-133和WIN55,212-2在MM中的抗肿瘤活性和抗血管生成的作用与机制,为其在临床应用提供新思路。 研究方法 1.体外实验以人恶性黑素瘤A375细胞为研究模型 应用免疫荧光检测CB-R2在A375细胞中的表达与定位;RT-PCR和Westernblot检测CB-R2在A375细胞中mRNA和蛋白水平的表达;Real time PCR和免疫组化检测CB-R2激动剂JWH-133和WIN55,212-2对A375细胞CB-R2表达的影响;MTT、划痕实验和Transwell小室模型检测JWH-133和WIN55,212-2对A375细胞增殖、迁移和侵袭作用的影响;Real-time PCR、和ELISA检测JWH-133和WIN55,212-2对A375细胞VEGF在mRNA和蛋白水平表达的影响;TUNEL检测JWH-133和WIN55,212-2对A375细胞凋亡的影响。 2.体内实验以人恶性黑素瘤A375细胞裸鼠移植瘤为研究模型 建立人恶性黑素瘤裸鼠移植瘤动物模型,观察体内成瘤情况。应用免疫荧光检测瘤组织中CB-R2的表达与定位;Real-time PCR、western blot和免疫组化检测CB-R2激动剂JWH-133和win55,212-2对肿瘤组织中CB-R2和VEGF在mRNA和蛋白水平表达的影响;TUNEL检测JWH-133和win55,212-2对肿瘤组织细胞凋亡的影响。 结果 1.人恶性黑素瘤A375细胞体外模型实验结果 ①人恶性黑素瘤A375细胞在mRNA和蛋白水平均表达CB-R2,其表达定位于胞浆和胞膜,胞核无染色。②不同浓度JWH-133和WIN55,212-2(0.01/0.1/1/10/100umol/L)对A375细胞增殖具有抑制作用,48h达到高峰(P＜0.05);而两种药物对A375细胞增殖的抑制作用,经统计学分析比较无明显差异(P＞0.05)。③JWH-133和WIN55,212-2抑制A375细胞的迁移和侵袭能力;与对照组比较,1umol/L浓度JWH-133组和WIN55,212-2组细胞相对迁移面积显著降低,差异具有统计学意义(P＜0.05);1umol/L浓度JWH-133组和WIN55,212-2组细胞穿膜细胞数与对照组比较明显减少,差异具有统计学意义(P＜0.05);而两种药物组的细胞相对迁移面积和穿膜细胞数,经统计学分析比较无明显差异(P＞0.05)。④不同浓度JWH-133和win55,212-2(1umol/5umol/10umol/L)刺激A375细胞24h,48h和72h后,可降低VEGF在不同时相点mRNA和蛋白水平的表达,与对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05);并且这种抑制效应呈时间剂量依赖关系,JWH-133和WIN55,212-2剂量越大,刺激时间越长,VEGF表达的降低越明显。⑤1umol/L浓度JWH-133和WIN55,212-2刺激A375细胞24h,48h和72h后,可诱导A375细胞凋亡,JWH-133组A375细胞凋亡率分别为7.22%、9.1 7%和11.45%;WIN5 5,212-2组A375细胞凋亡率分别为6.45%、8.12%和10.34%;而对照组凋亡率为6.35%、6.09%和6.39%,JWH-133组和WIN55,212-2组与对照组凋亡率比较,差异具有统计学意义(P＜0.05);而两种药物之间经统计学分析比较无明显差异(P＞0.05)。 2.人恶性黑素瘤A375细胞裸鼠移植瘤模型实验结果 ①JWH-133和WIN55,212-2可以抑制人恶性黑素瘤裸鼠移植瘤的生长,抑瘤率分别为43.14%和39.47%。②予JWH-133和WIN55,212-2,肿瘤组织可在mRNA和蛋白水平上调CB-R2的表达,与对照组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05);而两种药物之间经统计学分析比较无明显差异(P＞0.05)。③JWH-133和WIN55,212-2在mRNA和蛋白水平降低肿瘤组织中VEGF的表达;与对照组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05);两种药物之间经统计学分析比较无明显差异(P＞0.05)。④JWH-133和WIN55,212-2可诱导肿瘤组织中肿瘤细胞凋亡,对照组、JWH-133组和WIN55,212-2组肿瘤组织凋亡率分别为7.33%、12.84%和11.57%。JWH-133组和WIN55,212-2组与对照组凋亡率比较,差异具有统计学意义(P＜0.05);而两种药物之间经统计学分析比较无明显差异(P＞0.05)。 结论 1.大麻素Ⅱ型受体CB-R2参与了MM的发病过程; 2.JWH-133和WIN55,212-2可以抑制A375细胞增殖、迁移和侵袭的能力; 3.体外和体内实验模型中,JWH-133和WIN55,212-2可诱导MM肿瘤细胞凋亡: 4.体外和体内实验模型中,JWH-133和WIN55,212-2可降低MM肿瘤细胞和组织VEGF的表达和分泌,抑制血管生成,控制肿瘤的生长; 5.JWH-133和WIN55,212-2在抑制恶性黑素瘤细胞增殖、迁移、侵袭能力以及促进细胞凋亡等作用机制方面,二者无显著差异。
【学位授予单位】：中国人民解放军军医进修学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R739.5
【图文】：

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212一2组比较，差异具有统计学意义(只0.05)。HaCat细胞对照组各时间点细胞相对迁徙面积与药物刺激组比较变化不明显，差异无统计学意义(乃0.05)(见表2、表3和图10一11)。2.，」，H一133和WIN55，212一2对A375和HaCat细胞侵袭能力的影响Matrigel在聚碳酸滤膜表面重建可形成类似天然基底膜结构，细胞穿过Matrigel的能力反映细胞穿过基底膜能力，即细胞侵袭能力。对照组A375细胞穿过Matrigel细胞数较多，lumol/L浓度JwH一133和WIN55，212一2处理组A375细胞穿过Matrigel细胞数较少，与对照组比较差异具有统计学意义(只0.05)(见表4图12)。表 2A375细胞相对迁移面积值比较(药物浓度lum01/L)(x士s) 6roupIOD一F尸n二吕0h2魂 h48hC()NJ阳一1331660魂11:玉士29327.722936:38 11736213士 163吕 5.051872:考6.50土36895.93 155242.13士:考0161.:弓225士 216盛性.魂400士19797.7通:考 1.:30.0001Wl、55

【共引文献】

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本文编号：2719298