结合珠蛋白在正常及病损皮肤中的表达

发布时间：2020-06-24 16:46

【摘要】： 目的 1．探讨在正常及炎症刺激后，结合珠蛋白(haptoglobin，Hp)mRNA在小鼠表皮、真皮、表真皮组织中的表达情况，并采用原位杂交方法进行定位观察，以确定Hp mRNA在皮肤中的表达位置及其与炎症的关系。 2．在mRNA水平探讨正常人皮肤中Hp的表达，以进一步观察Hp mRNA在皮肤中表达的确切位置及其在不同部位皮肤中的表达差异；在蛋白质水平上研究Hp在正常人皮肤中的表达情况。 3．探讨Hp mRNA在银屑病患者皮损及皮损周边外观正常皮肤、扁平苔藓、红皮病、脂溢性角化病、寻常疣、基底细胞上皮瘤、鳞癌、系统性红斑狼疮患者皮损及曝光部位正常皮肤、天疱疮、大疱性类天疱疮患者皮损中的表达，进一步确定Hp mRNA在皮肤中的表达位置及在不同皮肤病中表达的差异；并在蛋白质水平观察Hp在上述皮损中的表达情况。材料和方法 1．标本收集 1．1实验动物 C57BL／6小鼠20只，分为生理盐水组和细菌脂多糖(LPS)刺激组，每组10只。均为雌性，2～4月龄。分别获取表皮、真皮和表真皮组织。 1．2正常人皮肤 30例正常成人皮肤来自外科手术患者，男19例，女11例。其中头皮2例，面部6例，躯干部13例，四肢9例。取材部位无肿瘤及炎症性皮肤病损害，所取皮肤组织均去除皮下脂肪组织。 1．3皮肤病患者皮损寻常型银屑病22例，其中进展期14例，稳定期8例，同时取16例患者的皮损周边外观正常皮肤；扁平苔藓16例；红皮病8例(2例由蕈样肉芽肿诱发，3例由银屑病诱发，3例由湿疹诱发)；脂溢性角化病15例；寻常疣10例；基底细胞上皮瘤10例；鳞癌10例；系统性红斑狼疮12例，同时取10例患者的曝光部位正常皮肤；天疱疮10例，其中寻常型7例，红斑型3例；大疮性类天疮疮10例。以上患者均经临床、组织病理及免疫病理学等检查确定诊断。 2．实验方法 2．l半定量RT－PCR 2．豆．l小鼠组织总RNA的提取所取组织制成匀浆后，用异硫氰酸狐－酚－氯仿一步法提取总RNA。 2．1．2总RNA浓度、纯度和完整性测定用紫外分光光度仪测定RNA在260urn和280run处的光密度值，以确定 RNA的浓度和纯度。用 1．5％甲醛琼脂糖凝胶电泳证实 RNA的完整性。 2．1．3对小鼠组织所提取的RNA进行RT—PCR检测分别按照要求制备反应体系并在特定条件下完成反转录及PCR反应，每一个标本均分别用HP和内对照p－actin引物对进行PCR扩增。HP特异性扩增片段长度为475hP，P－actin特异性扩增片段长度为54O hP。 2．2原位杂交法检测 2．2．l所有小鼠表真皮、正常人皮肤组织和皮肤病患者皮损组织均按照要求在－25℃恒冷切片机上制备12pm厚的切片。 LL二采用小鼠及人Hp原位杂交检测试剂盒进行检测。针对小鼠及人 Hp的 CDNA探针序列如下：5’－AGTGC TCCAC ATAGC CA’I’GT GCAAT CTCGG—3’，5’一 CCTGC CAGGG AAAGC TGCCT ITGGC ATCCA－3’，5’ 一 CATAC CAGGT GTCCT CCTCC AGGTC GTGAA—3’。 2．2．3对照的设立：阳性对照为小鼠肝组织；阴性对照为同一标本的切片省略生物素化鼠抗地高辛或省略探针。 2．3免疫组织化学［链霉卵白素标记的亲合素、生物素（LAB－SA）法厂染色对所有正常人皮肤组织和皮肤病患者皮损组织均用抗－地单克隆抗体、生物素标记的羊抗小鼠IgG及辣根酶标记的链霉卵白素进行检测。 2．4免疫荧光双标记检测对所有正常人皮肤组织和皮肤病患者皮损组织均用抗－Hp单克隆抗体、罗丹明标记的羊抗鼠哪和FITC标记的CDla单克隆抗体进行检测。 3．结果判断标准 ·2· 3．IPCR产物的检测扩增产物在＊5％琼脂糖凝胶中电泳，紫外凝胶成像系统上照相。电泳结果采用 Flo毗hem V 2．0凝胶成像分析软件（AInerica）分析，记录每条 DNA扩增带的灰度值，将每一个目的DNA扩增片段的灰度值与相应的内对照p－achn扩增片段的灰度值的比值（e／c）作为每一个目的基因InRNA 的半定量指标。 3．2原位杂交结果细胞浆染成桔红色为阳性，结果用 Meta Morph Im哈ng System软件处理，按图象灰度结果分为五个等级：无染色，灰度值不少于 130，为阴性（－入轻微染色，灰度值在125－130之间，为弱阳性（。＊染色较浅，灰度值在115刁之间，为阳性（＋＊染色较深，灰度值在105＊之间，为较强阳性（＋＋八染色深，灰度值不大于105，为强阳性（＋＋＋八 3．3免疫组化阳性细胞计数每个标本至少对三张连续切片进行计数，阳性树突状细胞以同时见到胞体和树突来确定。阳性树突状细胞的密度采用：线性密度＝阳性细胞剃 nun（表皮长度）和（或）阳性细胞数／rum＼表皮面积＊ 400倍显微镜下随机选取20个连续视野进行计数）来表示。 3．4免疫荧光双标记结果呈现树突状结构并发出红色荧光为HP表达阳性的细胞；呈现树突状结构并发出亮绿色荧光为CDla丫朗格汉斯细胞。 4．统计学处理： 4．l两组小鼠表皮和表真皮组织
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R751

【参考文献】