MicroRNA146a在UVB诱导的急性光损伤中作用机制的研究

发布时间：2020-07-09 11:55

【摘要】：研究背景随着地球臭氧层被破坏,紫外线辐射对人体健康的损害越来越受到人们的关注,日光中的紫外线(UV)是诱发光老化、光源性损伤包括皮肤肿瘤在内的主要因素。UVB导致的DNA损伤主要有包括两种光产物:嘧啶6-4光产物((6-4)PPs)和环丁烷嘧啶二聚体(CPDs),这两种光产物在正常情况下主要由核苷酸切除修复(Nucleoutide Excision Removal, NER)途径进行清除和修复,如果此途径失效,则光产物不能及时被清除,突变基因被大量复制,最终将会导致肿瘤发生。生物信息学作为21世纪自然科学的核心领域之一,其研究重点主要体现在基因组学(Genomics)和蛋白质组学(Proteomics)两方面,即从核酸和氨基酸序列出发,分析序列中表达的结构功能的生物信息。近年来,microRNA(miRNA)已经逐渐成为生命科学领域的研究热点。microRNA是指长度为21~25个核苷酸的小型非编码RNA家族,这些小RNA能够识别特定的目标miRNA并在转录后水平呈负调控基因的表现。研究表明,作为STATS(signal transducers and activators of transcription)家族的重要一员,STAT3在细胞增殖、存活、凋亡和炎症的生物学过程中具有重要作用。根据本课题组前期UVB诱导小鼠皮肤急性光损伤基因芯片的筛选结果,我们发现,miRNA146a在UVB辐射后出现显著下调,推测其在UVB诱导的急性光损伤中可能具有重要调控作用。目的根据前期对UVB诱导急性光损伤后小鼠皮肤中差异表达的miRNA基因芯片筛选的结果,进一步进行验证及生物信息学分析,选取miRNA146a作为研究靶点,探讨UVB照射诱导急性光损伤后miRNA146a在小鼠皮肤及人永生化角质形成细胞中表达的变化,之后以转染的方法过表达miRNA146a,观察其在HaCaT细胞中表达的变化及与JAK/STAT3信号通路的关系。方法 1根据课题组前期基因芯片筛选结果,利用在线数据库Targetscan预测靶基因,Gostat软件对其进行功能分析,Pathway软件对miRNA146a下游靶点基因进行分析; 2以C57BL/6小鼠为研究对象,经石蜡脱毛后分为时效组与量效组:时效组予UVB180 mJ/cm~2照射,以1、12、24、48h为取材时间点;量效组分别予30、60、90、180及270 mJ/cm2照射,24h后取材。首先运用HE染色方法观察小鼠皮肤组织的病理变化;其次采用免疫组化技术检测各组皮肤组织中STAT3和磷酸化STAT3的表达;最后以实时荧光定量PCR法检测各组小鼠皮肤中miRNA146a的表达水平; 3以含10%小牛血清及1%双抗的RPMI1640培养基体外培养HaCaT细胞,miRNA146a-模拟物转染HaCaT细胞,过表达miRNA146a后,分别以0、30、60、90mJ/cm2UVB照射诱导急性光损伤,MTT法检测细胞活性,流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况,实时荧光定量PCR法检测miRNA146a的表达, western blot技术检测miRNA146a相关JAK/STAT3信号转导途径中STAT3及p-STAT3的表达。结果 1生物信息学分析显示:miRNA-146a参与多种生物学功能,包括蛋白结合、发育进程、细胞分化等方面,traf6,smad4等miRNA146a的靶基因都是参与UVB诱导光损伤天然炎症免疫的重要基因,另外许多其他未经验证的靶点也具有非常重要的意义,由此可见:miRNA146a在UVB诱导的急性光损伤中可能具有重要的调控作用; 2量效组实验中,HE染色结果显示:随照射剂量增加,小鼠皮肤炎症反应逐渐加重,到270 mJ/cm~2时,小鼠表皮明显变薄。在时效组中,照射1h时炎症反应最重,随后逐渐减轻。 3免疫组化结果显示:随照射剂量的增加,STAT3表达逐渐增加,与炎症反应的强弱相关;而在时效组中,随着炎症反应逐渐减轻,STAT3表达也逐渐下调,p-STAT3表达也呈现类似趋势,但在正常小鼠皮肤中未见其阳性表达。通过相关性分析证实miRNA146a的表达分别与STAT3和p-STAT3的表达呈负相关(r=-0.92,p0.01;r=-0.981,p0.01); 4 UVB照射后,空白组、30、60、90、180及270 mJ/cm2量效组的miRNA146a表达水平分别为0.01158±0.00098、0.01083±0.00104、0.00872±0.00031、0.00851±0.00033、0.00810±0.00057、0.00770±0.00031,与UVB的辐射剂量呈负相关(r=-0.83,P0.05);而在时效组中,180 mJ/cm~2UVB照射1、12、24及48h后miRNA146a表达水平分别为0.00730±0.00036、0.00805±0.00035、0.00810±0.00057、0.00837±0.00039,各时效组与对照组相比,表达水平均有下调(P0.05); 5.随照射剂量增加,STAT3蛋白表达逐渐增加,而p-STAT3表达也逐渐增加。使用miRNA146a-mimics上调内源性miRNA146a后,STAT3及p-STAT3蛋白的表达较普通UVB照射组出现下调;以real-time PCR方法检测不同剂量UVB照射后各实验组中miRNA146a,结果显示:各剂量组中miRNA146a的表达较对照组而言均出现下调,结果具有统计学意义(P0.01)。结论 C57BL/6小鼠动物实验表明:UVB照射可诱导miRNA146a表达出现下调,而STAT3及p-STAT3蛋白表达上调;HaCaT细胞实验表明:过表达miRNA146a可下调STAT3及p-STAT3蛋白的表达,抑制UVB诱导的细胞凋亡,从而对细胞起到光保护作用。miRNA146a可能通过JAK/STAT3信号转导途径在UVB诱导的光损伤中发挥关键作用。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R758.1
【图文】：

信号通路,热混合,纳米微粒,离心机

材料和方法材料主要仪器）热混合仪 Eppend）不锈钢杂交盒 Agil）杂交盒载波片（G2534-60014 型） Agil）杂交烘箱摇床（G2530-60029 型） Agil）纳米微粒分光光度计（ND-1000 型） Thermo Fis）微量离心机 Brinkmann Instrum图 2.1 UVB 与 JAK/STAT3 信号通路之间的关系

实验组,背部皮肤,小鼠

180 mJ／cm212h，180 mJ／cm224h，180 mJ／cm2图 2.3 各实验组小鼠皮肤中 STAT3 的表达（IHC×200）表 2.2 不同剂量 UVB 照射小鼠背部皮肤后 STAT3 的表达（n=3，χ±s）组别正常组 30mj 60mj 90mj 180mj 270mjstat3 0.321±0.0170.382±0.009 0.409±0.015* 0.548±0.016* 0.649±0.017*0.717±0.00*注：*与正常组比较，p<0.05表 2.3 UVB 照射不同时间后小鼠背部皮肤 STAT3 的表达（n=3，χ±s）组别正常组 1h 12h 24h 48hstat3 0.321±0.017 0.692±0.013* 0.665±0.007* 0.649±0.017* 0.541±0.013*注：*与正常组比较，p<0.05

折线图,转染效率,实验组,细胞活性

图 3.2 miRNA146a-mimics 转染效率观察（×100） MTT 法检测细胞活性通过 MTT 法检测各实验组中的细胞活性，数据列表画出折线图，如图 3.3示：0h 时各实验组及对照组之间的细胞活性没有明显差异，至 6h 时各组间差出现，随着时间的增长，组间差异逐渐减小，到 72h 实验组与对照组及空白之间基本无明显差异。

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