抗角蛋白抗体对培养上皮细胞反应部位功能及相关机制研究

发布时间：2020-07-11 20:36

【摘要】： 人体内广泛存在着天然自身抗体(natural autoantibody, NAA)，它们对维持机体内环境的自身稳定起着重要的作用。目前国内外的学者已经不再把所有自身抗体看作是“可怕的自身毒素”，认为NAA是天然存在的自身抗体网络的组成部分，积极参与免疫系统自身稳定的调节。迄今为止已经发现并证实的NAA有数百种，其中包括天然抗角蛋白自身抗体(anti-keratin autoantibody, AK auto Ab)。 AK auto Ab是天然自身抗体NAA家族成员之一，广泛存在于正常人和多种动物体内，对皮肤的生理和病理过程具有重要调节作用。自从Krogh等于1970年首先发现AK auto Ab以来，国际上许多学者围绕AK auto Ab做了大量工作，如Iwatsuki等发现，未经任何免疫处理的小鼠脾细胞可自发地产生AK auto Ab；Hintner的体外实验间接发现AK auto Ab可以促进单核巨噬细胞对角蛋白凝集物的吞噬。本研究组自20世纪80年代中期开始对AK auto Ab进行了较为深入、细致的研究，研究进展与国际同步，某些方面已处于领先水平。所取得的主要进展有：①证实AK 第四军医大学博士学位论文2 auto Ah在正常人和多种动物体内广泛存在，明确其与皮肤多种生理和病理过程密切相关；②发现 AK auto Ah能够抑制培养角质形成细胞伙eratinoc刊e，KC）的增殖代谢，可以抑制KC产生兔疫介质如1＊－6、IL．8，促进＊C凋亡：首次提出＊K allt。＊b作为一种生理机制在维持皮肤自身稳定中具有重要作用。③利用未免疫小鼠 B细胞获得了 4株分泌 AK auto Ah的杂交瘤，克隆了抗体的可变区基因，发现其符合NAA的规律。④利用噬菌体抗体库技术获得了多株抗角蛋白基因工程抗体。⑤对 AK auto Ah进行了应用研究，初步结果显示AK auto Ah在银屑病治疗等方面具有良好的临床应用前景。在上述关于 AK auto Ah的研究中，最重要的发现之一是 AK auto Ah可以抑制培养的角质形成细胞及鳞癌细胞增殖。亲和层析纯化的血清AK auto Ah、鼠源性单克隆抗角蛋白抗体、基因工程抗角蛋白抗体都可显示这一抑制作用。但是 AK auto Ah发挥这一作用的机理目前尚未完全阐明。以往用 AK auto Ah作用固定后角质形成细胞（死细胞）结合对象是角质形成细胞胞浆内的角蛋白，而且还证实 AK auto Ah对不表达表皮角蛋白的细胞不具此作用，因此，我们推测 AK auto Ah 进入体外培养细胞（活细胞）胞浆与角蛋白结合是其发挥作用的基础。那么胞外的 AK autoAb是如何与活细胞胞浆内的角蛋白结合？AK autoAb与角蛋白结合后又发生了怎样的一系列事件而导致了角质形成细胞的增殖抑制？这些问题成为我们目前关注的焦点。过去普遍认为，抗体发挥其生物学活性的区域仅限于细胞外介质，而细胞内介质是抗体的禁区。但近年来大量资料显示，这种抗体内化现象广泛存在。抗体能够穿透活细胞进入细胞内与细胞核或 2 第四军医大学博士学位论文3 细胞浆内相应抗原结合，干扰细胞功能，引起细胞凋亡或死亡。从而提示 AK auto Ah 可能也能通过抗体内化进入活细胞与角蛋白结合而发挥作用。为了证明这一假设，我们采用免疫酶、共聚焦显微镜和胶体金透射电镜技术观察抗角蛋白抗体到底能否进入活细胞以及在活细胞内的确切定位。并进行基因工程抗角蛋白抗体Fab进入活细胞观察，以明确抗角蛋白抗体内化是否依赖于FC受体，初步探讨抗角蛋白抗体内化的跨膜机制。在此基础上，我们进一步明确了抗角蛋白抗体对Tea cells的作用，观察了抗体作用后角蛋白酪氨酸和 P38MAK磷酸化的变化，探讨了抗角蛋白抗体作用于角蛋白后对细胞功能的影响及作用的机制。主要实验内容和结果：一、抗角蛋白单克隆抗体进入活细胞的研究及跨膜机制初探 1不同浓度抗角蛋白抗体作用TCa细胞，相同浓度抗角蛋白抗体作用不同时间。黑素瘤细胞和抗HBsAg抗体作用的Tea细胞作为阴性对照。固定后用 AK auto Ah作用的k 细胞作为阳性对照。 2 免疫酶、免疫荧光法，Ethidium Homodimer 双染色。结果显示抗角蛋白抗体能够进入培养的几细胞，共聚焦显微镜观察抗角蛋白抗体能够进入活凡细胞胞浆。 3 全屏荧光定量法定量研究进入活Tea 细胞中抗角蛋白单克隆抗体，表明进入细胞的抗角蛋白单克隆抗体随着时间的延长浓度升高而增多，作用时间达到一定程度时，不再增加。 4 基因工程抗人角蛋白Fab也能进入培养的h 细胞。说明抗角蛋白抗体进入培养h 细胞是不依赖k受体的。 3 第四军医大学博士学位论文4 二、抗角蛋白单克隆抗体对体外培养细胞功能影响及作用机制 IMTT法证明抗角蛋白抗体对n 细胞增殖抑制作用具有时间、剂量依赖性。 2用抗角蛋白抗体作用的Tea细胞经处理后制备成超薄切片。然后用胶体金作用。结果表明，抗角蛋白抗体
【学位授予单位】：中国人民解放军第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R751
【图文】：

扫描图,抗体,培养细胞,共聚焦显微镜

抗体培养细胞(活细胞)细胞呈单一着染(x200)

固定细胞,双染色,抗体,胞核

图6固定细胞(死细胞)用抗体作用呈胞浆、胞核双染色(x40o)光定量法定量研究进入活Tca细胞中抗角蛋白单克隆抗体70抗角蛋白抗体分别作用Tca细胞30min、lh、Zh、7h、12h。lh一7h内随着时间增加，荧光强度逐渐增强长时间荧光强度不再增强。下图7一12是对以上细胞样本聚焦扫描的结果，下图13是采用全屏荧光定量法获得的光强度平均值。

抗体,荧光强度,细胞,样本

1:70抗角蛋白抗体分别作用Tca细胞30min、lh、Zh、3h、sh、7h、12h。lh一7h内随着时间增加，荧光强度逐渐增强，以后再延长时间荧光强度不再增强。下图7一12是对以上细胞样本相同层面共聚焦扫描的结果，下图13是采用全屏荧光定量法获得的细胞样本荧光强度平均值。

【参考文献】