EGCG对体外培养的人毛囊和毛乳头细胞生物学活性的影响及HIF-1α在人毛囊和毛乳头细胞中的表达的研究

发布时间：2020-07-15 20:06

【摘要】： 毛囊是哺乳动物特有的一种结构复杂的皮肤附属器官,是一个富含干细胞,由神经外胚层和中胚层交互作用形成的系统。一生不断经历生长期、退行期和休止期的周期性循环。毛乳头对诱导和维持毛囊的周期性循环必不可少,其大小决定了毛囊的大小和生长期的长短。毛乳头细胞具有确定和维持毛母质细胞增殖分化的作用,而毛球部毛母质细胞的增殖分化是毛囊周期性生长调控的关键。与其他组织器官的再生一样,上皮细胞与相应间质细胞间的相互作用在毛囊的周期性生长调控中具有重要意义。 绿茶是一种全世界受到广泛欢迎的饮料,EGCG是绿茶茶多酚的主要活性成分之一,具有广泛的生物学活性,已有大量研究表明其具有清除氧自由基抗氧化、抗肿瘤及对紫外线辐射的光保护等作用。但EGCG对毛发生长及毛乳头细胞增殖的影响国内还未见报道。 低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是1992年由Semenza在Hep3B细胞株中发现的一种DNA结合蛋白,可调控多种基因的表达。其中HIF-1α是专一调节O_2的HIF-1亚单位,决定了HIF-1的活性,它与靶基因结合,促进其转录,使机体产生一系列低氧适应反应。现已证实HIF有调节红细胞生成、铁代谢、血管形成和葡萄糖代谢等多种作用,同时随着对HIF-1α研究的进展,发现其与细胞生长的各种应答机制有密切的关系。 由于毛囊生长的关键部位(毛球部)深埋于真皮深层,皮肤表面的局部用药很难渗透到毛球部,而成纤维细胞紧邻表皮下方,并包裹在毛囊周围。我们研究小组前面的研究中已经做到将目的基因HIF-1α通过脂质体直接导入成纤维细胞,导入后在毛囊周围的成纤维细胞表达和分泌某些关键因子,如VEGF,FGF等,从而发挥促毛发生长的作用,达到治疗毛发疾病的目的。作为该课题的一部分,本实验证明了HIF-1α在毛囊和培养的毛乳头细胞中的表达,进一步为研究HIF-1α促进毛发生长的机理提供了理论依据。 本课题的研究主要包括以下两部分: (一)EGCG对体外培养的人毛囊和毛乳头细胞生物学活性的影响 显微分离人毛囊,在加入不同质量浓度EGCG(0～250 mg/L)的Williams E培养基中培养,观察毛囊生长情况;利用两步酶法分离培养人毛乳头细胞,加入不同质量浓度的EGCG(0～500 mg/L),48 h后,利用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期。结果显示与空白对照组比较,0.1,1 mg/L的EGCG对体外培养的毛囊生长有明显促进作用(P＜0.05);MTT显示15.6,31.2,62.5 mg/L的EGCG能够明显促进毛乳头细胞的增殖(P＜0.05);流式细胞仪检测7.8,15.6,31.2和62.5 mg/L的EGCG作用48 h后,S期和G2/M期细胞比率明显增加,G0/G1期细胞比率明显减少,细胞增殖指数明显增加(由5.25%增至5.64%,14.61%,32.51%,37.35%),细胞增殖指数与EGCG浓度呈显著正相关(r=0.933)。因此,我们得出结论一定浓度的EGCG能够促进体外培养的人毛囊生长及人毛乳头细胞增殖。 (二)HIF-1α在人毛囊和毛乳头细胞中的表达 分离完整的人生长期毛囊,提取总RNA,RT-PCR法检测HIF-1αmRNA的表达。利用两步酶法分离培养人毛乳头细胞,取第三代毛乳头细胞,分为正常培养组和200μM氯化钴处理组。提取总RNA,RT-PCR法检测HIF-1αmRNA的表达;提取细胞总蛋白,用Western blot法检测人毛乳头细胞中HIF-1α蛋白的表达;用免疫荧光法进一步检测人毛乳头细胞中HIF-1α蛋白的表达并定位。RT-PCR显示人毛囊及分离培养人毛乳头细胞均表达HIF-1αmRNA。Western blot显示200μM氯化钴处理的人毛乳头细胞表达HIF-1α蛋白,正常培养组未能检测到HIF-1α蛋白。免疫荧光显示200μM氯化钴处理的人毛乳头细胞胞浆、胞核中均有HIF-1α蛋白的表达,正常培养组未能检测到HIF-1α蛋白。因此我们可以得出结论人毛囊和毛乳头细胞均可表达缺氧诱导因子,但常氧下HIF-1α蛋白迅速降解,故免疫荧光、Western blot检测不到。氯化钴可模拟缺氧环境,加氯化钴处理的人毛乳头细胞免疫荧光、Western blot均检测到HIF-1α的表达。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R751
【图文】：

500林g/mL对毛乳头细胞有毒性作用 (P<0.05)(图1一2)。台铮招侧袱以硕口 e1.953.，， .e15.‘ 31262.512525C500ECC贷褪力诬〕与对照组相比*P<0.05图1一2:不同浓度EGCG对人毛乳头细胞增殖的影响 3.3EGCG对人毛乳头细胞细胞周期的影响EGCG对人毛乳头细胞细胞周期影响的流式细胞仪结果如图3所示。EGCG处理组与正常对照组相比细胞周期有明显差异，且呈剂量相关性。随着EGCG浓度的增大，S期细胞比率逐渐增高;G:期细胞比率先是增高，但是当浓度达到62.5呵毗时，G:期细胞比率较前一浓度又有下降;Gl期细胞比率逐渐降低。细胞增殖指数(PI)随着EGCG浓度的加大逐渐增高，经相关分析，两者呈正相关，r=0.933。EGCG对毛乳头细胞的凋亡率没有明显的影响。(见表1一2)

ECC贷褪力诬〕与对照组相比*P<0.05图1一2:不同浓度EGCG对人毛乳头细胞增殖的影响 3.3EGCG对人毛乳头细胞细胞周期的影响EGCG对人毛乳头细胞细胞周期影响的流式细胞仪结果如图3所示。EGCG处理组与正常对照组相比细胞周期有明显差异，且呈剂量相关性。随着EGCG浓度的增大，S期细胞比率逐渐增高;G:期细胞比率先是增高，但是当浓度达到62.5呵毗时，G:期细胞比率较前一浓度又有下降;Gl期细胞比率逐渐降低。细胞增殖指数(PI)随着EGCG浓度的加大逐渐增高，经相关分析，两者呈正相关，r=0.933。EGCG对毛乳头细胞的凋亡率没有明显的影响。(见表1一2)

白面向下置于发光液上lmin，然后将PVDF膜的蛋白面向上另一张塑封膜上，赶净气泡，并将塑封膜的蛋白面向上放入片夹中，压一张x片，盖上片夹，分别曝光305、lmin、Zminin。取出X片，依次显影Zmin，流水冲洗，定影1min，流水冲洗.9观察条带情况，凝胶成像系统扫描分析。果HIF一1amRNA在人毛囊中的表达Rl仁PCR显示人毛囊表达HIF一1amRNA，其目的条带大小p(图1)。经基因测序，与GeneBank公布的序列完全一致。

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 李涛;人毛囊的无血清培养基器官培养[J];国外医学.皮肤性病学分册;1994年03期

2 罗洋,郝飞,钟白玉,麦跃,姜晓勇;人毛乳头细胞生长相关蛋白作用下细胞VEGF的表达[J];中国美容医学;2004年03期

3 陈志强;胰岛素及胰岛素样生长因子对培养的人毛囊的影响[J];国外医学.皮肤性病学分册;1995年04期

4 韩勇;李英春;李琳;;螺内酯对体外培养的人毛囊影响的实验研究[J];医学研究生学报;2006年02期

5 周春丽,叶庆佾,郝飞,刁庆春;分离酶法体外分离和培养人毛囊黑素细胞[J];中华皮肤科杂志;2001年05期

6 邹锋,郝飞,宋志强,易勇,郝进,钟华,叶庆佾;HSPC016基因重组工程菌发酵研究[J];第三军医大学学报;2005年09期

7 Commo S,Gaillard O,Bernard BA;人头发毛囊外根鞘中有二个不同的K19阳性区:干细胞储库的统一假说?[J];中华皮肤科杂志;2003年04期

8 唐建兵,陈璧,汤朝武,胡大海,董茂龙;人毛囊外根鞘细胞的培养[J];中华烧伤杂志;2003年01期

9 姜yN群;白介素、集落刺激因子和肿瘤坏死因子在体外培养中对人毛囊生长的影响:白介素1和α肿瘤坏死因子可能与斑秃发病有关[J];国外医学.皮肤性病学分册;1997年06期

10 张国强;程毅;李玲;高顺强;;胰岛素样生长因子1和成纤维细胞生长因子7与毛乳头细胞的生长[J];中国组织工程研究与临床康复;2010年50期

相关会议论文 前3条

1 唐建兵;陈璧;汤朝武;胡大海;董茂龙;;人毛囊外根鞘细胞的培养[A];中华医学会第六届全国烧伤外科学术会议论文汇编[C];2001年

2 郑业华;杨恬;;人毛囊干细胞与皮脂腺细胞共培养的体外实验研究[A];中国细胞生物学学会第八届会员代表大会暨学术大会论文摘要集[C];2003年

3 崔志鸿;杨恬;;uPA对毛囊周期的调控作用[A];中国细胞生物学学会医学细胞生物学、免疫细胞生物学和发育生物学专业委员会学术研讨会论文摘要汇编[C];2002年

相关博士学位论文 前2条

1 罗洋;人毛乳头细胞生长相关蛋白生物学活性的初步研究[D];第三军医大学;2004年

2 杨卫兵;HSPC011和HSPC016基因在毛乳头细胞的表达及其生物学功能的研究[D];第三军医大学;2003年

相关硕士学位论文 前2条

1 李梅云;EGCG对体外培养的人毛囊和毛乳头细胞生物学活性的影响及HIF-1α在人毛囊和毛乳头细胞中的表达的研究[D];南京医科大学;2008年

2 戴叶芹;缺氧诱导因子-1的表达对毛囊细胞及毛囊生长的影响[D];南京医科大学;2007年

本文编号：2756952