人乳头瘤病毒6bL1双顺反子载体的构建及其在哺乳动物细胞内的表达

发布时间：2020-07-21 09:26

【摘要】： 目的构建尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒6b型晚期基因(HPV6b L1)的双顺反子表达载体，并使其在哺乳动物细胞内表达，以期建立含有人乳头瘤病毒6b型晚期基因的细胞模型，便于进一步研究人乳头瘤病毒L1蛋白的分子生物学特性和对其免疫学干预及治疗的研究奠定基础。 方法表达质粒pEGFP-HPV6bL1经双酶切纯化后与经过相同双酶切的真核表达质粒pIRES2-EGFP连接，热冲击入感受态大肠杆菌DH5α，经扩增后酶切鉴定，挑选阳性克隆进行测序。重组质粒pIRES2-HPV6bL1-EGFP应用阳离子脂质体转染技术将其转染进NIH3T3细胞，荧光显微镜下观察EGFP蛋白的表达，RT-PCR检测HPV6b L1 mRNA的生成。 结果通过双酶切及测序鉴定，重组质粒中插入的目的基因片断及载体DNA大小、方向和插入位点均正确，pIRES2-HPV6bL1-EGFP构建成功。重组体成功转染进NIH3T3细胞，并用选择性培养基G418筛选。同时荧光倒置显微镜下可观察到细胞内有绿色荧光蛋白的表达。进一步进行RT-PCR，检测到HPV6b L1 mRNA的生成。 结论携带HPV6b L1的重组体pIRES2-HPV6bL1-EGFP成功构建，并转染进NIH3T3细胞。经荧光倒置显微镜观察及RT-PCR方法检测证明HPV6b L1在NIH3T3细胞内成功表达。该研究成果可望进一步用于研究人乳头瘤病毒晚期基因L1蛋白的生物学特性和进行防治疫苗的基因工程研究。
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R752.53
【图文】：

第二部分材料及方法实验材料1标叫HPV6bLl(1500bP)构建并保存。基因开放读码框的重组质粒PEGFP一HPV6bLI为(1)(2)(3)菌株:E.collDH5a菌株(由暨南大学医学院中心实验室保存)。质粒:含增强型绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载PIREsZ一EGFP(由暨南大学医学院中心实验室保存)。细胞:小鼠成纤维细胞(NIH3T3)(购自中山大学实验动物中心

文人乳头瘤病毒6bLI双顺反子载体的构建及其在哺第三部分实验结果的基因重组质粒的酶切电泳}PV6bLI重组质粒经BanHI单酶切后，取酶切产泳，结果显示(见图4)，在紫外透射反射检测仪上GFP一CI长度(4.7kb)和HPV6bLI长度(1.skb)(见图3)。

培养后提取质粒DNA为模板及空载体作双酶切。0.8%琼脂糖电泳，紫外透射反射检测仪上观察可见一条1.SKb的目的片断和4.7kb的载体片断，与预期的结果相符(见图5)，可以初步证实上述HPV6bLI片段已插入到表达质粒pIRESZ一EGFp中，重组质粒pIRESZ一HpV6bLI一EGFp构建成功。12223bP2.0kb’、、 1.sk卜4254bPl。ok卜489bP25bP图5重组质粒pIREsZ一HpV6bLI一EGFp的酶切鉴定 Fig.5IdentifieationofrccombiantPlasmidPIRESZ一HPV6bLI一 EGFPbyrestrietiondigestion Ml:DNAMarkerVllMZ:人一 EeoT141digestDNAMarker l:rceombiantPlasmidPIRESZ一HPV6bLI一 EGFPdigested withBamH1andSael2:HPV6bLI2.测序鉴定将所构建重组质粒PIRESZ一HPV6bLI一EGFP进行酶切初步鉴定后，送上海生工生物公司对插入片段进行测序，结果显示与原序列一致(全长15O3bp)，可以进·步证实重组质粒Pl既52一HPV6bLI一EGFP构建成功(见附录1和附录2)。

【参考文献】

相关期刊论文 前5条

1 蔡萍;人乳头瘤病毒16型对细胞增殖、分化及凋亡的影响[J];国外医学.病毒学分册;2002年05期

2 蒋仁举,王泓;人乳头瘤病毒与细胞凋亡[J];微生物学免疫学进展;2004年01期

3 刘方,王家璧,刘跃华,左亚刚,蔓小红,王惠珍;间接免疫荧光技术检测尖锐湿疣中的人乳头瘤病毒[J];中国性科学;2003年01期

4 郑燕芳,张积仁,屈良鹄,汪森明,周惠,赵锦;抗HPV16E_6核酶的原核表达与体外活性研究[J];中华微生物学和免疫学杂志;2000年01期

5 洪少林,王家璧,刘跃华,司静懿,许雪梅,郭秀婵,曾毅;北京地区尖锐湿疣患者皮损中人乳头瘤病毒的检测和分型[J];中国医学科学院学报;2002年04期

本文编号：2764227