人毛乳头细胞生长相关蛋白生物学活性的初步研究

发布时间：2020-07-24 18:30

【摘要】：在组织器官(如牙齿、肠、羽毛等)的发育和再生过程中,上皮细胞和间质细胞的相互作用具有极为重要的意义。研究表明,位于毛囊底部的特殊间质成分——毛乳头在毛囊的形态学发生和毛囊的周期性生长调控中起主导作用。毛乳头细胞作为毛囊的主要间质成分,在毛囊研究中具有相当重要的地位。在胚胎发育过程中,毛乳头细胞来源于位于表皮基板下方的一群凝集性生长的真皮间质细胞。在鼠触须、鼠体被毛、羊和人皮肤等分离培养毛乳头细胞,培养的毛乳头细胞在形态上类似于真皮成纤维细胞,但一般均表现为凝集性生长方式,在培养皿中形成相互重叠的细胞团,而周围则形成空隙;真皮成纤维细胞则表现为平铺式的融合性生长。在培养情况下,毛乳头细胞的凝集性生长特性将随着细胞传代次数的增多而逐步丧失,一般情况下,第6代以后细胞不再表现凝集性生长。凝集性生长是毛乳头细胞的重要生物学特性之一,凝集性生长与毛乳头细胞的功能和分化状态有关。但是毛乳头细胞凝集性生长的分子机制不明,同时凝集性生长状态下毛乳头细胞所分泌的蛋白在毛囊发育和毛囊周期性生长调控中的作用也少有研究。毛乳头是一个可诱导毛囊生长的结构,它能发送或接受信号,从而影响毛囊的发育和周期性生长。最近研究发现了许多在毛囊形态学发生和周期性生长中起作用的信号分子,如成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors, FGFs)、骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)、神经营养因子、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor , PDGF)等。这些信号分子大多来源于毛囊上皮细胞,它们构成了一个复杂的网络,尚不能确定其中具有关键作用的因子。研究这些因子可能难以从根本上阐明毛囊发育和周期性生长的具体机制,但是我们对于毛乳头细胞自身分泌的生长相关蛋白在其凝集性生长和毛囊周期性生长调控中的作用知之甚少,因此有人提出,毛乳头细胞自身分泌的生长相关蛋白将是今后毛囊研究的重要内容。鉴于以上认识,我们认为研究毛乳头细胞凝集性生长状态下所分泌的特异性蛋白有助于阐明毛乳头细胞凝集性生长、毛囊发育及周期性生长调控的分子机制。因此,通过国家自然科学基金资助课题(编号30200249) 及重庆市科委重点攻关课题(编号2001-8-4) WP=13 收集凝集性生长人毛乳头细胞培养液上清制备成条件培养基,分别作用于传代培养后失去凝集性生长特性的毛乳头细胞和临床斑秃患者,用来阐明毛乳头细胞生长相关蛋白对活力较弱毛乳头细胞的影响和对毛囊生长周期的调节作用,以期为临床治疗秃发性疾病探索一种新的治疗途径。在本研究中,我们首先从人头皮毛囊分离培养人毛乳头细胞,这些细胞具有周期性凝集性生长特性,而且这种特性随着传代次数的增多而逐步丧失。凝集性生长作为毛乳头细胞的固有特性与其生物学功能密切相关。我们收集凝集性生长人毛乳头细胞培养液上清制备成条件培养基,培养9代毛乳头细胞,发现其能将非凝集性生长的毛乳头细胞转化为凝集性生长状态;我们又将条件培养基培养的9代毛乳头细胞与基础养基培养的9代毛乳头细胞分别作细胞计数,发现条件培养基有明显促进高传代毛乳头细胞增殖的能力;我们再将2代毛乳头细胞与9代毛乳头细胞共培养,发现9代毛乳头细胞有向低传代毛乳头细胞转化的趋势,而2代毛乳头细胞未出现向高传代转化的趋势。这些结果表明凝集性生长毛乳头细胞所分泌的生长相关蛋白与毛乳头细胞的凝集性生长等生物学特性有关。我们应用3H-TdR掺入技术,发现基础培养基培养的毛乳头细胞,其3H-TdR掺入值随着细胞传代增高而降低,而对应的条件培养基培养的高传代毛乳头细胞其3H-TdR掺入值是相对较高的,这表明条件培养基可促进活力较弱的高传代毛乳头细胞的增殖;我们应用RT-PCR技术,观察分泌性蛋白血管内皮生长因子mRNA的表达状况,发现基础培养基培养的毛乳头细胞,其血管内皮生长因子mRNA的表达随着细胞传代增多而降低,而对应的条件培养基培养的高代毛乳头细胞其血管内皮生长因子的表达是相对较高的,这表明条件培养基可促进活力较弱的毛乳头细胞的分泌性蛋白的基因表达;我们再在电镜下观察条件培养基培养的高代毛乳头细胞,发现其细胞核靠边,细胞内核糖体较多,内质网分泌成池,呈圆形和椭圆形,而用基础培养基培养的高传代毛乳头细胞,其电镜下可见其细胞核居中,细胞内核糖体较少,内质网分泌成星形或条索状,这表明条件培养基可促进活力较弱的高传代毛乳头细胞的分泌。这些结果表明凝集性生长毛乳头细胞所分泌的生长相关蛋白可促进活力较弱高传代毛乳头细胞的增殖和分泌性蛋白的表达和分泌。我们收集凝集性生长人毛乳头细胞培养液上清制备成毛乳头细胞条件培养液冻干粉,经热源试验、急性毒性试验、细菌培养、真菌培养等检查无异常,经查排除人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒螺旋体感染,经本院伦理委员会讨论同意临床使用,并征得患者同意且签署知情同意书的情况下应用于斑秃患者。我们发 WP=14 现在50例毛乳头细胞条件培养液治疗的斑秃患者中,除2例无效外其余均有一定疗效,这与去炎松治疗组比较取得了良好的疗效。毛乳头细胞条件培养液组、去炎松组和空白组治愈率分别为74%、50%、10%,有效率分别
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R751
【图文】：

毛乳头

二、毛乳头细胞的培养：将获得的毛乳头接种于培养瓶中做悬浮培养。一般接种后 8hrs 即开始贴壁（图1-1），24hrs 后贴壁率可达 95％。第二天贴壁后便有细胞从毛乳头边缘长出。在开始的 3~4 天，细胞生长较快，向四周呈放射状生长（图 1-2），此时毛乳头逐渐失去其原来的形状，形成成片的细胞生长致密区。含胎牛血清的培养基培养的毛乳头细胞在散开 10 天后又开始逐渐融合，而用含新生牛血清的培养基培养的毛乳头细胞在散开 14天后才开始逐渐融合，融合后细胞大致仍由呈放射状排列的多个细胞团组成，中央区细胞出现多层化并向上堆积(凝集性生长)。凝集性生长初期的毛乳头细胞多呈多角形或长三角形，尤其是凝集团中央区的细胞，周边区细胞则多呈梭形，形态类似成纤维细胞，但前者胞体较大。经胰酶消化并传代的毛乳头细胞，可在 2hrs 内贴壁并铺开生长。细胞排列方式开始时欠规则，随着细胞数目增多，毛乳头细胞逐渐重新倾向凝集生长。随着时间的增加，凝集生长现象逐渐明显，如果不给予传代干预，则向上堆积成细胞球。用含胎牛血清的培养基培养的毛乳头细胞 5 天后开始逐渐融合

人毛乳头细胞生长相关蛋白生物学活性的初步研究

3天后毛乳头细胞向四周呈放射状生长(xaoa

人毛乳头细胞生长相关蛋白生物学活性的初步研究

代毛乳头细胞融合前可见凝集性生长现象〔X40)

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