外泌体对毛乳头细胞生物学活性的影响

发布时间：2020-07-28 08:38

【摘要】：背景和目的近年来人们的脱发发病率逐渐增长,严重影响患者的身心健康。治疗脱发方法包括自体毛囊移植术、口服非那雄胺、外用米诺地尔等,但存在副作用、停药后脱发进程会继续,因此探索新的有效的方法有必要。关于其实验研究包括组织工程毛囊重建、毛囊细胞克隆、毛囊细胞移植疗法等,其中得益于组织工程研究发展迅猛,毛囊重建在治疗脱发的研究中较有前景。毛囊的重建需要大量及具有生物学活性的种子细胞,包含有毛囊干细胞(hair follicle stem cells,HFSC)及毛乳头细胞(dermal papilla cells,DPC)。毛囊是皮肤附属器的器官,由真皮组分和表皮组分组成。DPC聚集在毛乳头(DP)内,DP在毛球部被毛母质细胞等包绕。HFSC与DPC相互作用形成新的毛囊,DPC被认为是毛囊形态发生和周期性生长必需的。但DPC在体外经过多次扩增培养,它的生物学活性逐渐消失,因此,改善或维持DPC在体外培育扩增后的诱导活性,是组织工程毛囊重建中重要一步。外泌体,为来源细胞通过旁分泌细胞外排形成的囊泡,直径约为30-150nm,其内携带有来源细胞的DNA、RNA、多种蛋白质等物质,可存在于细胞培养上清液、血液等。因此我们在本实验中通过使用低代数DPC来源的外泌体培养高代数DPC,尝试以其改善DPC的生物学活性,为毛囊重建提供有效的种子细胞,为脱发治疗提供新的研究思路。方法:1.鼠触须垫DPC的分离培养及外泌体的提取与鉴定通过显微解剖+酶消化法获取小鼠触须垫的DP,观察其形态、贴壁和迁出情况,并对细胞进行传代培养扩增。收集低代数DPC的培养上清液并通过超速离心法提取外泌体,并采用粒径检测、电镜观察和外泌体表面标志蛋白检测鉴定。2.外泌体培养DPC对其生物学活性的检测通过添加外泌体培养第3代(P3)和第8代(P8)的DPC,并通过CCK8、qRT-PCR、WB检测其生物学活性。3.经外泌体培养的DPC诱导毛囊再生的研究使用外泌体培养后的DPC及新生鼠的上皮细胞通过注射法进行毛囊重建,通过体视镜、组织切片HE染色观察情况。结果:1.通过显微解剖+酶消化法能获取小鼠触须垫的DP,细胞正常迁出,扩增培养后DPC呈聚集性生长,但随着传代次数的增加,DPC逐渐失去聚集性生长的特性,且细胞增殖能力减弱。通过超速离心法能提取出直径30-150nm、表达特异性标志蛋白的外泌体。2.添加外泌体培养不同代数的DPC结果显示P3、P8实验组细胞增殖能量较对照组高,P3、P8实验组细胞的相对特异性标记物也较对照组的表达水平高。3.使用外泌体培养的P3和P8的DPC用于毛囊重建,可见P3实验组及对照组均能诱导毛囊再生,而P8组仅实验组能诱导毛囊重建,且再生毛囊数量少。结论:1.通过显微解剖+酶消化法可获取小鼠触须垫的DP,并未影响细胞迁出及DPC的形态、生长特性和增殖活性。通过粒径检测、电镜观察和外泌体表面标志蛋白检测鉴定使用超速离心法可提取出较纯丰富的外泌体。2.添加外泌体培养不同代数的DPC,可部分改善DPC的生物学活性。3.使用外泌体培养的高代数DPC仍能诱导毛囊再生。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R758.71
【图文】：

逦第一章邋Ｃ５７ＢＬ／６小鼠触须垫毛乳头细胞来源的外泌体的提取及鉴定逦逡逑ｍｕｍ邋ｍｍ逡逑图１－１邋Ｃ５７ＢＬ／６小鼠触须垫原代毛乳头培养及观察。Ａ．显微解剖＋酶消化法获得的鼠毛逡逑乳头（２００Ｘ）；邋Ｂ．原代毛乳头接种贴壁１天后（４０Ｘ）；邋Ｃ．原代毛乳头家中贴壁５天后（４０逡逑Ｘ）；邋Ｄ．原代毛乳头家中贴壁５天后（４０Ｘ）。比例尺＝５００邋ｕｍ。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｉｓｏｌａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｐｒｉｍａｒｙ邋ｄｅｒｍａｌ邋ｐａｐｉｌｌａｅ邋ｏｆ邋ｍｏｕｓｅ邋ｔｅｎｔａｃｌｅ邋ｐａｄ邋ｉｎ逡逑ｖｉｔｒｏ．邋Ａ．ｔｈｅ邋ｉｓｏｌａｔｉｏｎ邋ＤＰ，邋ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋Ｘ２００邋ｔｉｍｅｓ邋；Ｂ．邋ｔｈｅ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ＤＰ邋ａｆｔｅｒ邋１逡逑ｄａｙ，邋ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋Ｘ４０邋ｔｉｍｅｓ；邋Ｃ．邋ｔｈｅ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ＤＰ邋ａｆｔｅｒ邋５邋ｄａｙｓ，邋ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋Ｘ４０邋ｔｉｍｅｓ；逡逑Ｄ．邋ｔｈｅ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ＤＰ邋ａｆｔｅｒ邋７邋ｄａｙｓ，邋ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋Ｘ４０邋ｔｉｍｅｓ，邋ｓｃａｌｅ邋ｂａｒｓ：邋５００叫ｎ．逡逑

■■■■■■逡逑ｆ逡逑■逡逑图１－２Ｃ５７ＢＬ／６小鼠触须垫各代数毛乳头细胞体外培养及生长特性观察。Ａ．Ｐｌ－ＤＰＣ，可逡逑见明显的细胞聚集性生长；Ｂ．Ｐ３－ＤＰＣ，亦可见细胞聚集性生长；Ｃ．Ｐ５－ＤＰＣ，细胞仍呈聚集性逡逑生长；Ｄ．Ｐ６－ＤＰＣ，细胞聚集性生长现象较低代数的明显减少；Ｅ．Ｐ８－ＤＰＣ，无明显的细胞聚集；逡逑Ｆ．Ｐ１０－ＤＰＣ，未见细胞聚集，且细胞呈衰老现象。（１００Ｘ）比例尺＝２００邋ｕｍ。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ａｎｄ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ邋ｏｆ邋ｍｏｕｓｅ邋ＤＰＣ邋ｅａｃｈ邋ｐａｓｓａｇｅｓ邋ｉｎ邋ｖｉｔｒｏ．邋Ａ．ＰＩ逡逑１４逡逑

图１－４外泌体的鉴定

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本文编号：2772632