寻常型银屑病患者皮损和血清中肿瘤坏死因子alpha及其受体的检测及其相关性研究

发布时间：2020-07-28 11:27

【摘要】： 前言银屑病以表皮角质形成细胞过度增生和淋巴细胞浸润为特征。免疫异常在其发病过程中起着重要作用。免疫调节主要是通过细胞因子相互作用来实现的，银屑病皮损和／或外周血存在TNF-α及其受体的异常。研究表明，银屑病皮损TNF-α的免疫反应性和生物学活性明显升高。冻融的银屑病皮损上清液含有大量的TNF-α；角质形成细胞、血管内皮细胞和表皮树突状细胞上的粘附分子表达增高，角质形成细胞和真皮血管内皮细胞上的TNF-α表达增高，提示TNF-α可能通过干预银屑病皮损区粘附分子表达而参与银屑病的发生。然而，并不能在银屑病皮损内始终如一地检测到TNF-α。 TNF-α通过与其受体(TNFR)结合发挥其生物学效应。有报道银屑病皮损处表皮全层和真皮血管周围浸润细胞均表达TNFR-Ⅰ，并认为TNF-α可通过与TNFR-Ⅰ结合而作用于角质形成细胞等；银屑病皮损表皮不表达TNFR-Ⅱ，真皮内浸润炎性细胞表达TNFR-Ⅱ。随后的研究发现银屑病皮损表皮TNFR-Ⅰ的含量明显增高，TNFR-Ⅱ轻度增高，并认为TNF-α受体的局部或系统释放可能调节TNF-α的作用效果。可见TNFR-Ⅰ和TNFR-Ⅱ在银屑病皮损处的表达仍不十分明确。国内尚未见有关于TNF-α及其受体在银屑病皮损边缘外观正常皮肤表达与否的研究报道。近年来，人们对银屑病患者外周血是否存在TNF-α及其受体的异常表达进行了研究，Gomi等检测21例寻常型银屑病患者血清TNF-α，结果表明TNF-α的水平无明显改变。随后的研究发现银屑病外周血TNF-α的血清水平明显升高。最近有人在对银屑病患者巨细胞病毒与TNF-α关系的研究中也观察到了血清TNF-α水平增高。上述研究结果提示外周血TNF-α可能参与了银屑病的发生。外周血可溶性TNF-α受体(sTNFRs)对体内TNF-α的生物学活性起着重要的调节作用，但sTNFRs与银屑病方面的研究报道很少。近年来的研究发现银屑病血清sTNFR-Ⅰ的含量明显增高；还有报道关节病型银屑病外周血TNF－a含量降低，sTNFR－I和sTNFR一见的活性上调。n－ FRs参与免疫过程，sTNFRs浓度反映细胞免疫活性，与TNF－a和其它可溶性免疫物质卜几一ZR）等密切相关。同时检测银屑病皮损和外周血TNF －。及其受体水平对于分析皮损局部与整体TNF－a及其受体变化的关系非常必要。目前尚未见同时比较皮损局部与外周血TNF－a及其受体变化的实验资料。为此，本文应用兔疫组织化学方法对银屑病皮损、皮损边缘外观正常皮肤TNF－a及其受体的表达进行研究；用 ELISA方法检测银屑病血清 TNF 一。及其受体含量，以探讨皮损和血清TNF－a及其受体在银屑病发生发展中的作用。国内外尚未见银屑病皮损表皮TNF－。及其受体InRNA表达与否的研究报道，本文应用RT—PCR方法检测寻常型银屑病患者皮损表皮 TNF—a及其受体的mRNA相对量，以探讨TNF－a及其受体mRNA对寻常型银屑病皮损TNF－a及其受体的影响。材料和方法二．标本收集 O）患者诊断确认：所有寻常型银屑病患者均经临床和组织病理确诊。收集47例病例的皮损47份，外周静脉血20份，并从外周静脉血中分高血清20份。 p）献血员和正常对照：采集正常献血员外周静脉血20份，并从中分高血清20份。收集整形外科手术切除的正常皮肤34份。 2．皮损中 TNF—a及其受体’YNFR—I和 TNFR一见的检测分别以抗人 TNF－a、TNFR－I和 TNFR－11为一抗，采用免疫组织化学方法对皮损和皮损边缘外观正常皮肤表皮及真皮内单一核细胞’I’NF一。及其受体TNFR—I和TNFR－11的表达进行研究。 3．用EllSA法检测血清中TNF－a及其受体的含量采用人TNF－。ELISA试剂盒检测银屑病患者血清中TNF－a，利用人 sTNFR ELISA试剂盒检测银屑病患者血清中 sTNFR－I和 sTNFR—11。 4．表皮RNA提取JNA纯度和浓度测定及其浓度的调定 O）真皮表皮分离：用inn－na’缓冲液剥离表皮。 ·2· p）以目前通用的TRIZOL方法提取正常人表皮和寻常型银屑病患者皮损表皮总 RNA。橱）提取的总RNA用紫外分光光度计测定260run和280urn的光密度（ODX并根据此OD值计算RNA的浓度和纯度，用DEPC水调定RNA浓度至 0．5 pg／汕 5．逆转录合成山NA 遵循 wmesa试剂盒的操作要求，取 z…（含二％nx）ns稀释液进行逆转录。经变性和逆转录过程之后，将产物 CDNA按 1：4稀释并分装，一 20℃冻存，以供PCR使用。 6．引物设定（l）p一actin内对照5！物利用［me6引物设计软件涉tip：人。 g6。。帧．Mt．edVcgi－ biatPrimer／Priltle6·c矽）设计内对照引物对：民／p卯（2）TNF－a、TNFR一互和 TNFR－11弓物本文采用已有文献报道的TNF－a、TNFR－I和TNFR－11片段为模板设计 PCR弓物对：T；／TZ、11／IZ和几／＊。 7·PCR扩增条件采用20gi反应体系，其中含 10 x Biber【M4”reeX…，dNTP卜」 3．6…，MgCI＊．二…，Taq DNA聚合酶0·4…，CDNA模板4PI，引物口2．5
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：R758.63

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