RNA聚合酶Ⅰ抑制剂CX-5461对银屑病及相关病理性血管新生的药理作用

发布时间：2020-07-28 14:58

【摘要】：研究背景银屑病是一种常见的慢性免疫炎症性增生性皮肤病,病程长,且易复发。临床表现主要以红斑,鳞屑,瘙痒为主。银屑病的主要组织病理学表现为表皮细胞过度角化,炎细胞浸润以及毛细血管增生。银屑病的病因及发病机制目前尚不完全清楚。但目前认为银屑病的发生不是单一因素的结果,可能涉及多个方面,如遗传背景、感染、免疫异常、内分泌因素、精神紧张等。目前,临床上用于治疗银屑病的药物副作用大,并且无法达到根治的目的。因此寻找新的药物靶点具有十分重要的意义。CX-5461是一种新型的特异性RNA聚合酶Ⅰ(PolⅠ)抑制剂。以往研究证实,CX-5461能够抑制肿瘤细胞增殖,对某些白血病和实体肿瘤表现出较好的治疗效果。我们课题组在前期研究中发现,CX-5461对机械损伤引起的动脉血管内膜增生和再狭窄有显著的抑制作用,对移植后血管新生内膜增生和血管炎症的发展也有抑制作用,并且CX-5461能够有效抑制心肌成纤维细胞的活化及表型转化。CX-5461是否对银屑病病变的发生发展有抑制作用目前尚没有研究。研究目的在本研究中,我们使用成熟的银屑病模型和血管新生模型,探索PolⅠ特异性抑制剂CX-5461 对银屑病以及内皮细胞血管新生功能的药理作用。研究方法用咪喹莫特乳膏处理C57BL/6小鼠皮肤建立银屑病模型。CX-5461溶于DMSO中,局部皮肤涂抹给药。将小鼠随机分成4组:正常对照组(sham)、造模+ DMSO组(溶剂对照)、造模+CX-5461低剂量组(2μM)、造模+CX-5461高剂量组(5μM)。局部涂抹治疗1周后,取材进行组织病理学和分子生物学检测。HE染色观察角质层厚度变化。免疫组织化学染色观察炎症细胞CD68阳性细胞数量。Lectin和CD31染色观察血管新生情况。用实时定量PCR方法检测肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素(IL)-17、IL-23、IL-6、IL-8、IL-10、IL-1[β的表达。体外培养人角质形成细胞(Hacat),用流式细胞术检测细胞周期。用皮下种植海绵垫以及腹部皮下注射Matrigel方法建立血管新生模型。将种植海绵垫的C57BL/6小鼠随机分成4组:生理盐水对照组、血管内皮生长因子(VEGF)刺激组、CX-5461组、CX-5461 +VEGF组。将腹部皮下注射Matrigel的C57BL/6小鼠随机分成3组:Matrigel组、CX-5461低剂量组(2μM)组、CX-5461高剂量组(55μM)。2周后取材进行组织学检测。免疫组织化学及Lectin染色观察新生血管数量的变化。体外培养人毛细血管内皮细胞,用CCK-8法检测细胞增殖能力,用划痕实验检测细胞迁移能力,用小管成型实验检测细胞的成管能力,用流式细胞术检测CX-5461对细胞周期的影响。用Western bolt检测内皮细胞中p53及磷酸化p53的蛋白水平。研究结果在银屑病模型中,CX-5461明显改善了银屑病的皮肤症状(病变皮肤表面鳞屑减少,皮肤皱褶减少,红肿明显减轻)。HE染色结果显示,与溶剂对照组相比,CX-5461治疗明显抑制了角质细胞的增生。免疫组织化学染色发现,CX-5461治疗组病变部位的新生血管数量与溶剂对照组相比明显减少。另外我们发现CX-5461能够减轻病变部位的炎症反应。免疫组织化学检测结果显示,与对照组相比,CX-5461治疗组CD68+细胞数明显减少。实时定量PCR结果显示CX-5461 治疗组 TNF-α、IL-17、IL-23、IL-lβ 的表达水平下降,而 IL-6、IL-8、IL-10的表达升高。在皮下种植PVA海绵垫血管新生模型中,CD31染色及Lectin化学染色显示,VEGF组与对照组相比血管数量明显增加;CX-5461治疗显著减少了基础水平和VEGF刺激后的血管新生过程。在Matrigel胶血管新生模型中,CD31免疫化学染色显示,CX-5461治疗显著减少了血管新生数量。体外培养的细胞中,CX-5461对血管内皮细胞的增殖有剂量依赖性的抑制作用。同时,CX-5461能明显抑制血管内皮细胞的迁移能力和成管能力。并且,CX-5461对角质形成细胞和内皮细胞的细胞周期有抑制作用,可以将细胞阻滞在G2/M期。在血管内皮细胞中,CX-5461对p53蛋白总量的作用不明显,但能显著增加p53磷酸化水平。用p53抑制剂PFT-α预处理能够减轻CX-5461对内皮细胞迁移的抑制作用,而对内皮细胞成管能力的作用不明显。结论局部应用CX-5461能有效抑制银屑病病变的发生发展,减轻炎细胞浸润和病变部位的血管新生。CX-5461抑制血管新生的作用可能与激活p53通路有关。因此,特异性Po1 Ⅰ抑制剂可能为开发治疗银屑病的新型药物制剂提供线索。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R758.63
【图文】：

咪喹莫特,银屑病,药理作用

图１邋ＣＸ－５４６１对咪喹莫特（ＩＭＱ）诱导的银屑病病变的药理作用逡逑．大体观察ＩＭＱ诱导的皮肤银屑病样改变（红斑及白色鳞屑）。ＣＸ－５４６１减轻银屑病样皮损（统计观察：红斑鳞屑面积／皮损暴露总面积）。Ｂ．ＨＥ染色观察ＣＸ－５４６１对表皮层厚度的影响。右侧为统计数据图（平准差）。＊＊＊Ｐ＜0．000ｌ，ｏｎｅ－ｗａｙ邋ＡＮＯＶＡ，ｎ＝７。逡逑

病变部位,血管新生,银屑病,免疫组织化学染色

图２邋ＣＸ－５４６１对ＩＭＱ诱导的银屑病病变部位血管新生的影响逡逑Ａ．ＣＤ３１免疫组织化学染色显示病变部位毛细血管（红色箭头）数量变化（左：逡逑２0ｘ放大倍数；右：左图方框内放大）。Ｂ．红色荧光标记的Ｌｅｃｔｉｎ染色观察各逡逑组病变部位毛细血管数量变化（白色箭头）。下方为统计数据图（平均值土标准逡逑差）。＊Ｐ＜邋０．０５，＊＊＊Ｐ＜０．０００１，ｏｎｅ－ｗａｙ邋ＡＮＯＶＡ，邋ｎ＝７逡逑２８逡逑

病变部位,单核巨噬细胞,真皮层,免疫组织化学染色

图３邋ＣＸ－５４６１对病变部位皮肤炎症反应的影响逡逑Ａ．邋ＣＤ６８免疫组织化学染色显示真皮层单核巨噬细胞浸润情况的变化（红色箭逡逑头）。右侧为统计结果。Ｂ．实时定量ＰＣＲ结果显示，ＣＸ－５４６１治疗后病变部位逡逑细胞因子邋ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０邋表达升高，ＴＮＦ－ｏｕ邋ＩＬ－ｉｐ、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３邋的表达降逡逑低。＊Ｐ＜０．０５，＊＊＊Ｐ＜０．０００１，ｏｎｅ－ｗａｙＡＮＯＶＡ，ｎ＝７逡逑２９逡逑

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