肢端角化性类弹性纤维病致病基因及其相关致病机制的研究

发布时间：2020-08-06 10:43

【摘要】：背景本研究以肢端角化性类弹性纤维病(Acrokeratoelastoidosis,AKE)的家系为研究对象。先证者主要表现为双手多发的、坚实的、角化性丘疹,主要位于掌指关节、近端指间关节骨性隆突处。多个丘疹融合呈“铺路石”样外观,其中皮疹以掌背交界处最为显著。其家系中的其他成员也有类似的病史。目的1)通过对该家系进行遗传学研究,探索AKE可能的致病基因。2)探索AKE相关的致病机制,为该疾病的诊断与治疗奠定基础。方法1)对一个常染色体显性遗传AKE家系中的四个成员(Ⅱ-2,Ⅲ-7,Ⅳ-3,Ⅳ-4)进行全外显子测序(WES)分析。2)应用Primer Premier 5.0软件对候选基因所在的突变位点设计引物,运用PCR扩增及Sanger测序方法将候选基因在该家系19名成员和60例与该家系无血缘关系的健康对照个体中进行验证,分析该基因在该家系内是否与疾病存在共分离现象。3)在另一例AKE家系对可疑致病基因进行筛选验证。4)构建以慢病毒载体的sh RNA,在293T细胞中进行病毒包装,最后转染至人皮肤成纤维细胞中形成稳定转染的细胞株p LKO.1 sh-CCDC91。通过细胞免疫荧光(ICC)及透射电子显微镜(TEM)方法,对CCDC91基因的亚细胞定位和可能的机制进行研究。结果1)通过WES技术,经过滤过筛选出8个可能的候选基因,分别为OVCH2:p.G257D,CELSR3:p.A157P,TRAIP:p.R157H,CD180:p.N207S,OTP:p.A71V,ERAP2:p.T407,RIOK2:p.D140N和CCDC91:c.993+1GA。2)Sanger测序结果显示,该AKE家系的致病基因为CCDC91,且该基因在该家系中所有的患病个体中存在,未患病个体中不存在。3)在另一例AKE家系中对CCDC91基因进行Sanger测序,结果发现CCDC91基因的错义突变(c.941AG,p.K314R)。4)ICC结果显示CCDC91基因的亚细胞定位在高尔基体上。TEM结果显示相比于p LKO.1 Sh-Control组,p LKO.1 sh-CCDC91B2组细胞的高尔基体肿胀、碎裂,溶酶体及自噬体数量增多,且细胞质内可见异常囊泡的蓄积。结论1)CCDC91基因是AKE的致病基因。2)CCDC91基因的亚细胞定位于高尔基体,CCDC91蛋白的结构改变可能影响囊泡之间的运输,使得弹力蛋白的合成与分泌减少,从而导致AKE的发生。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R758.4
【图文】：

成员,先证者,斜线,外显子

10图 1 箭头指的是先证者，是正常男性，是男性患者；是正常女性，是女性患者，带斜线表示该成员已过世，“＋”代表进行全外显子测序的成员。A、B 分别为 AKE-1 和 AKE-2 的

手掌,丘疹,外观,背屈

图 2 AKE-1 家系的临床与组织病理学表现。（A）双手对称性角化性丘疹主要位于掌指关节及近端指指关节突起处。（B）手掌处多个光滑的、肤色丘疹，部分融合呈“铺路石”样外观，且皮疹分布以背屈侧交界处最为显著。（C-D）浸泡 5 分钟后,手背和手掌皮损发白，肿胀呈“海绵样”外观。（E）组织病理学表现。表皮增生，明显的正角化过度，颗粒层和棘层增生，真皮

测序,产物,基因测序,家系

图 3 PCR 产物的测序图（A）（B）分别是 AKE-1 和 AKE-2 家系 CCDC91 基因测序图。方框代表突变碱基所在位置。Fig. 3 Sequencing pictures of PCR products.Aand B were sequencing pictures of CCDC91 gene inAKE-1 andAKE-2 families, respectively. The box represents the location of the mutant base.

【相似文献】