杨梅黄酮对紫外线诱导的皮肤光老化保护作用及潜在机制研究

发布时间：2020-08-06 20:13

【摘要】：研究背景皮肤光老化(skinphotoaging)是指日光中的紫外线照射皮肤后引起的慢性炎症过程。引起光老化的紫外线主要是长波紫外线(UVA)、中波紫外线(UVB)。目前,由于环境污染、臭氧层被破坏,人们接受紫外线辐射、光老化问题日益严重,成为困扰大众的一个严重的社会问题。因此开发具有高活性成分的防晒产品以及具有抗氧化活性的药物来抵抗紫外线的辐射,预防和延缓皮肤老化已成为当前医学研究的热点。杨梅为杨梅科杨梅属植物,果实甜酸可口,自古以来就被用于食疗。近年来已经证明杨梅提取物中的杨梅黄酮是发挥药理作用的主要化学成分之一。杨梅黄酮具有多种生物学活性,包括抗癌防癌、抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化等等。也有研究显示杨梅黄酮可用作皮肤的光保护剂。但是杨梅黄酮对紫外线诱导的皮肤光老化保护作用及潜在机制尚不清楚。研究目的1、通过建立体外光老化模型,探索紫外线照射对表皮角质形成细胞及真皮成纤维细胞结构和增殖,氧化损伤作用以及对基质金属蛋白酶MMP-1表达的影响。2、探讨杨梅黄酮对紫外线引起的表皮真皮结构和各种代谢改变的保护作用,进一步探讨其保护机制。研究方法第一部分:杨梅黄酮对紫外线照射后的原代成纤维细胞损伤的保护作用取新鲜皮肤组织用Dispase酶消化,分离上皮和真皮层成纤维细胞,采用组织块贴壁法培养真皮层成纤维细胞。紫外照射剂量分别为UVA+UVB(5mJ/cm2)、UVA+UVB(15mJ/cm2)、UVA+UVB(30mJ/cm2)、UVA+UVB(60mJ/cm2),观察细胞存活率以及细胞形态,选择照射剂量UVA+UVB(15mJ/cm2)建立成纤维细胞紫外线照射后的光损伤模型。分别用不同浓度杨梅黄酮对细胞进行预处理,24小时后,以UVA+UVB(15mJ/cm2)进行照射,照射后继续以相应浓度杨梅黄酮孵育24小时后,观察细胞形态并进行计数,计算细胞存活率,采用MTT法检测细胞增殖活性,比色法检测成纤维细胞培养上清中羟脯氨酸(Hydroxyproline,HYP)含量,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测MMP-1分泌水平。第二部分:杨梅黄酮通过IκB/NF-κB信号通路抑制UVB辐射对角质形成细胞的损伤分别采用不同UVB照射剂量(0、15、20、25、30mJ/cm2)照射人永生化角质形成细胞HaCaT,采用MTT方法检测HaCaT细胞的活力。选择20mJ/cm2(HaCaT细胞的活性降低将近50%)作为造模剂量,UVB照射后分别用不同浓度杨梅黄酮和生理盐水(对照组)处理细胞。采用MTT方法检测HaCaT细胞的活力,流式细胞术分析UVB辐射下的细胞的ROS含量,运用Western Blot和RT-PCR分别检测NF-KB信号通路标志蛋白pIκB和IκB及下游蛋白COX2蛋白及mRNA表达水平。第三部分:杨梅黄酮对紫外线所诱导的小鼠皮肤光损伤的保护作用50只白色雄性小鼠剃除背部绒毛,随机分为5组,每组10只:A组:空白对照组;B组:UVA+UVB照射;C组:UVA+UVB照射+杨梅黄酮低浓度组(5mg/ml);D组:UVA+UVB照射+杨梅黄酮中浓度组(20mg/ml);E组:UVA+UVB照射+杨梅黄酮高浓度组(50mg/ml)。小鼠经均匀涂抹生理盐水(对照组)或杨梅黄酮30min后,每组均隔日照射UVA+UVB1次,照射强度UVB为0.18mW/cm2,UVA为1.25mW/cm2,第1周到第7周每次照射时间为30min,自第8周开始后照射时间每周延长1Omin,到第12周时照射时间为80min,到14周停止紫外线照射(最终UVA辐射剂量累计为139.86J/cm2,UVB辐照剂量累计为21.38J/cm2)。在紫外线照射过程中,定期观察各组小鼠背部皮肤,试验结束后采用Glogau法对小鼠背部皮肤进行分级。末次UVA十UVB照射实验结束后,取小鼠背部照射区皮肤组织进行HE染色和胶原纤维染色,倒置显微镜观察小鼠背部皮肤组织形态学及真皮内胶原纤维的变化。照射区皮肤检测SOD、HYP、T-AOC水平。提取照射区皮肤组织总RNA,通过RT-PCR测定MMP-1及IκB mRNA表达水平。研究结果第一部分:杨梅黄酮对紫外线照射后造成的原代成纤维细胞损伤的保护作用与空白对照组相比,UVA/UVB辐射组成纤维细胞后,随着辐射剂量的增加,细胞数量明显减少,并且表现出解体、排列紊乱、脱颗粒现象。随着辐射量的提升,成纤维细胞(fibroblast,FB)的存活率明显变小。即紫外线辐射可以损伤FB细胞的活力,致其凋亡坏死。与单纯照光组相比,杨梅黄酮给药组FB细胞的活力随着杨梅黄酮浓度的增加而逐渐升高。与正常对照组相比,UVA/UVB辐射后胶原蛋白分泌量降低,用杨梅黄酮处理后发现,杨梅黄酮浓度在50μg/ml以下时可提升紫外线照射后成纤维细胞培养上清中总胶原分泌量。在浓度为50μg/ml时,总胶原分泌量显著增加(P0.05)。研究还发现杨梅黄酮浓度为50μg/ml时可以显著抑制成纤维细胞中的MMP-1分泌(P0.05),而当杨梅黄酮浓度大于100μg/ml以上时,MMP-1的分泌水平较单纯照射组反而增加。第二部分:杨梅黄酮通过IκB/NF-κB信号通路抑制UVB辐射对角质形成细胞的损伤UVB剂量的逐渐增加,HaCaT细胞的存活率随之降低(P0.05)。即UVB辐射可以损伤HaCaT细胞的活力,致其凋亡坏死。当辐射量达到20mJ/cm2,HaCaT细胞的活性降低将近50%。我们选择20mJ/cm2的UVB照射HaCaT细胞,采用不同杨梅黄酮(0、5、15、25、35、50μM)处理细胞,结果表明,与生理盐水对照组相比,HaCaT细胞的活力随着杨梅黄酮的浓度升高而逐渐提高。低浓度的杨梅黄酮对细胞的保护作用不显著(P0.05),而杨梅黄酮浓度达到50μM时,HaCaT细胞的存活率可达80%左右。经UVB照射后,HaCaT细胞的ROS水平上调,不同浓度的杨梅黄酮可逐渐降低HaCaT细胞的ROS水平,表明杨梅黄酮可以有效抑制UVB辐射诱导HaCaT细胞的ROS水平。紫外线照射后的HaCaT细胞的COX2 mRNA和蛋白水平均显著上调(P0.05),杨梅黄酮可以有效抑制UVB辐射诱导的COX2 mRNA和蛋白水平,且随着杨梅黄酮含量的升高,COX2的mRNA和蛋白水平逐渐降低。UVB照射后,细胞内的NF-κB信号通路标志蛋白pIκB水平表达上调(P0.05),IκB未产生明显变化(P0.05),当采用50μM的杨梅黄酮处理细胞,PIκB表达被抑制,IκB未产生明显变化。第三部分:杨梅黄酮对紫外线所诱导的小鼠皮肤光损伤的保护作用白色小鼠背部皮肤脱毛给予UVA+UVB连续照射14周后,背部皮肤出现明显光老化改变:成纤维细胞损伤甚至破碎,胶原纤维断裂,排列紊乱,胶原纤维含量下降,同时伴有单核炎症细胞的浸润。照射前分别外用浓度为5mg/ml、20mg/ml、50mg/ml的杨梅黄酮涂抹,结果显示杨梅黄酮可以不同程度地减轻胶原纤维变性,胶原纤维破坏减少,排列趋于整齐,含量升高,同时炎症细胞浸润明显减少(P0.05)。小鼠皮肤经紫外线照射后抗氧化酶SOD、T-AOC的活性均有所下降,涂抹杨梅黄酮后各组抗氧化酶活性均有所升高(P0.05)。超氧化物歧化酶SOD各组比较差异有统计学意(P0.05),当杨梅黄酮浓度为5mg/ml,T-AOC活性明显升高,HYP含量显著升高。当浓度为5mg/ml、20mg/ml 时,MMP-1 mRNA 水平显著升高(P0.05)。结论杨梅黄酮在一定浓度范围内对紫外线照射的皮肤光损伤有一定的防护作用;杨梅黄酮可以增强照射后细胞的增殖活力、提高氧化酶活性;并且杨梅黄酮通过IκB/NF-κB信号通路抑制细胞因子MMP-1的分泌来发挥抗皮肤光老化的作用。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R758.1
【图文】：

图２杨梅黄酮可以抑制ＵＶＢ诱导的细胞凋亡逡逑注：＊表示Ｐ＜０．０５逡逑２、杨梅黄酮可以显著降低ＵＶＢ辐射诱导的ＲＯＳ水平逡逑采用流式细胞术进一步分析在ＵＶＢ辐射下的ＲＯＳ含量以及经过杨梅黄酮逡逑处理后ＨａＣａＴ细胞的ＲＯＳ水平变化（图３）。结果显示，经过ＵＶＢ辐射之后，逡逑ＨａＣａＴ细胞的ＲＯＳ水平显著上调（Ｐ＜０．０５），但是经过不同浓度的杨梅黄酮处理逡逑之后发现，ＨａＣａＴ细胞的ＲＯＳ水平逐渐降低，当达到杨梅黄酮的浓度达到逡逑５0ｎＭ时，ＨａＣａＴ细胞的ＲＯＳ水平相比对照组基本持平，表明杨梅黄酮可以有逡逑效抑制ＵＶＢ辐射诱导ＨａＣａＴ细胞的ＲＯＳ水平。逡逑

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逡逑蛋白，用蛋白免疫印迹技术检测细胞的ｐｌｔｃＢ和ＩｋＢ蛋白表达（图５）。结果发逡逑现，ＵＶＢ辐射后，细胞内的ＰＩｋＢ水平表达显著上调，ＩｋＢ未产生明显变化，当逡逑采用５０ｐＭ的杨梅黄酮处理细胞，发现ｐＩｊｃＢ表达被抑制，ＩｋＢ仍未产生显著的逡逑变化。因此，我们推测杨梅黄酮可能是通过ＮＦ－ｋＢ信号通路来发挥抑制紫外辐逡逑射对细胞的损伤作用。逡逑ＵＶＢ邋２０邋ｒｎＪＷ逡逑知邋５邋Ｔ逦ｃｏｎｔｒｏｌ邋０逦５０邋（曊逡逑２逦４－５邋—？逦Ｉ逡逑？Ｓ邋４邋－？逦｜逡逑ｇ邋ｒｔ邋３邋－－逦ｐ－ｌＫＤ0ｔ逡逑Ｐ；１：：逦■逡逑Ｉ逦}桢澹椋蓿拢徨澹恚恚恚停恚恚恚恚恚礤义

本文编号：2782906