【摘要】：背景:恶性黑色素瘤多发于皮肤,虽然发病率仅占所有皮肤癌的4%,但其死亡率却占皮肤癌死亡率的80%;只有14%的转移性黑色素瘤患者存活了五年,而且皮肤黑素瘤的发病率逐年增加。p53是一种常见的肿瘤抑制因子,并且由于其对细胞周期和凋亡基因的转录调控而被广泛研究。p53限制糖酵解并驱动ETC装配和维持所需基因的转录。除了线粒体活性的转录调控之外,p53还直接作用于线粒体以通过与Bcl-2家族成员的相互作用来诱导细胞凋亡以响应应激。p53作为Bax的转录诱导剂,p53是DNA损伤与细胞凋亡之间的关联。同时,p53还限制糖酵解并通过许多途径抑制过度的核苷酸、氨基酸和脂肪酸合成,恶性黑色素瘤代谢引起了人们的关注。代谢重编程是癌细胞增殖和转移的能量基础。UT-B是参与尿素跨膜转运的膜通道蛋白。已有文献报道发现膀胱癌中尿素通道蛋白B(urea transporter B,UT-B)的表达下降,并且随着肿瘤恶性度增加。UT-B是膜上介导尿素快速跨膜转运的通道蛋白,主要在肾脏表达参与尿浓缩功能,还广泛分布于皮肤、大脑、心脏、肝脏等肾外组织。已有实验证明改变膜上UT-B的表达会影响细胞内外尿素的瞬时浓度,可能会导致肿瘤细胞氨基酸、糖、脂肪等的变化,从而影响细胞能量代谢。因此,人们推测UT-B可能通过黑色素瘤的发生发展有关。p53在暴露于高盐和尿素后启动细胞周期延迟中发挥重要作用,因此可能提供足够的时间修复DNA损伤或启动细胞凋亡,这可以阻止受损DNA的增殖。文献报道UT-B基因敲除小鼠的心肌细胞发生线粒体功能障碍,能量代谢重构。提示过表达UT-B引起的细胞凋亡可能与线粒体凋亡途径有关。目的:瞬时转染UT-B表达质粒,使B16细胞中UT-B的表达上调,通过体内、体外实验研究UT-B过表达后对黑色素瘤细胞生长的影响,并初步探讨其作用机制。方法与结果:(1)人黑色素瘤组织中UT-B表达下降我们应用HE免疫组织化学染色方法,检测人皮肤癌芯片(上海芯超公司)各组织中UT-B的表达水平。在正常皮肤组织中可见UT-B阳性表达,主要是在基底层细胞可见大量棕黄色斑片和颗粒。在芯片中的8例皮肤黑色素瘤组织中仅有少量棕色颗粒和斑片,在黑色素瘤中UT-B蛋白表达降低。我们又收集人皮肤痣和人黑色素瘤组织4例,提取RNA进行RT-PCR实验,检测UT-B mRNA的表达水平。结果显示其中3例患者的黑色素瘤组织几乎没有UT-BmRNA的表达,另1例黑色素瘤组织中UT-B mRNA有弱表达,进一步证实了黑色素瘤发展过程中UT-B mRNA和蛋白水平都明显下降。(2)黑色素瘤B16细胞中过表达UT-B后细胞生长受抑制、凋亡增加RT-PCR检测发现黑色素B16细胞株中无UT-B mRNA表达。通过转染UT-B表达质粒,上调B16细胞中UT-B的表达水平,对照组转染p CDNA3.1空质粒。Western Blotting和免疫荧光检测证实B16细胞转染pUT-B 48h后具有较高的UT-B蛋白表达水平。流式细胞术实验发现转染UT-B表达质粒后,相比于对照组,B16细胞出现G2/M期阻滞。MTT实验证明转染pUT-B 48h后,B16细胞的生长活力下降(下降到对照组的32.4%),划痕实验表明过表达UT-B后的B16细胞的迁移能力也明显下降4倍左右,并且克隆形成实验显示B16细胞的克隆形成能力下降。以上结果说明过表达UT-B抑制了B16细胞的生长和增殖。Annexin V/PI染色后应用流式细胞术检测细胞凋亡,发现转染UT-B表达质粒后,相比于对照组(6.85%±1.24%),B16细胞凋亡明显增加(11.63%±1.67%,p0.05)。Hoechst染色显示过表达UT-B的B16细胞中核固缩和核碎片状增加,凋亡小体增多(p0.05),也证明细胞凋亡增加。另外,Western Blotting实验表明促凋亡蛋白Bax和Cleaved-Caspase3的表达水平增加(p0.05),抑凋亡蛋白Bcl2的蛋白表达水平下降(p0.05),说明过表达UT-B后促进了B16细胞凋亡。(3)黑色素瘤B16细胞中过表达UT-B后可能通过激活p53、线粒体损伤诱导细胞凋亡据报道UT-B基因敲除小鼠的心肌细胞中线粒体功能障碍,提示UT-B表达水平的变化极可能影响线粒体功能。DCFH-DA荧光探针染色后应用流式细胞术检测细胞ROS水平,结果显示UT-B表达48h后,B16细胞中ROS产生增多(比对照组增加18.7%,p0.05),线粒体膜电势下降(p0.05),而细胞耗氧量明显下降(降低到对照组的54.8%,p0.05)。同时Western Blotting检测发现过表达UT-B的细胞中线粒体电子传递链中复合体I,III,IV和V的相关重要亚基NDUFV1,CYC1,COX7C和ATP5F1的表达水平明显下降(p0.05),清除氧自由基相关酶SOD2的表达水平也明显下降(p0.05),CYC1从线粒体释放至胞质明显增加。以上说明UT-B过表达后B16细胞线粒体功能下降,从而启动线粒体凋亡途径来诱导细胞凋亡。在UT-B基因敲除小鼠中膀胱上皮细胞的线粒体损伤是p53依赖性的,本研究也调查了黑色素瘤中过表达UT-B是否也是与p53有关。应用Western Blotting发现过表达UT-B上调了B16细胞中p53和下游p21的表达。AKT的激活促进MDM2的核进入,降低p53的细胞水平。本研究发现转染UT-B表达质粒后p-AKT的表达水平下调,与之相对应MDM2表达下调(p0.05)。以上说明转染UT-B表达质粒抑制B16细胞增殖可能通过激活p53和线粒体途径诱导了细胞凋亡。(4)脂代谢相关酶的表达和糖摄取在B16细胞中,在过表达UT-B后,Western Blotting检测发现葡萄糖转运蛋白GLUT1的表达降低,并且分光光度计法检测发现葡萄糖摄取减少。RT-PCR实验检测发现脂肪合成关键酶FASN,SREBP1的mRNA的表达降低。以上结果说明在B16细胞中过表达UT-B可能会影响细胞糖代谢和脂代谢。(5)在小鼠黑色素瘤移植瘤中UT-B过表达也明显抑制肿瘤生长,可能与p53途径有关构建小鼠黑色素瘤移植瘤模型,将小鼠分成PQ组、PQ-P(PQ-p CDNA3.1)组和PQ-U(PQ-UT-B)组。以具有肿瘤靶向性的减毒沙门氏菌作为运载体,携带p CDNA3.1和pUT-B,以尾静脉注射的方式给予小鼠,观察肿瘤生长情况和小鼠生长状态。结果显示PQ-U组肿瘤中UT-B的表达水平高于对照组PQ组和PQ-P组。肿瘤中过表达UT-B进行治疗(14天),肿瘤体积增长速率和重量都较对照组明显降低,说明过表达UT-B抑制了黑色素瘤生长。同时Western Blotting检测到肿瘤细胞中BAX上调,Bcl2下调。过表达UT-B增加了p53和p21的表达水平,降低了Mmd2和p-AKT的表达水平。结论:1、与人正常皮肤相比,人黑色素瘤组织中具有较低的UT-B表达水平,推测改变UT-B表达可能会影响黑素瘤细胞的增殖和生长。2、UT-B能诱导B16细胞中促凋亡蛋白BAX和Cleaved-Caspase3表达显著升高,同时还低表达抑凋亡蛋白Bcl2。表明UT-B具有促进B16细胞凋亡,抑制其生长和增殖的作用。3、UT-B能诱导B16细胞中线粒体膜电位下降,线粒体中细胞色素C表达减少,细胞中细胞色素C表达增多,表明UT-B可能是通过线粒体途径促进细胞凋亡。4、UT-B能诱导葡萄糖转运蛋白Glut1表达减少,抑制细胞内葡萄糖的摄取,并降低脂肪酸合成酶关键酶的表达,表明UT-B对细胞的抑制作用可能与代谢抑制有关。5、UT-B能抑制磷酸化AKT表达,通过p53的负调控因子MDM2激活p53,p53,来抑制糖代谢与脂代谢和诱导线粒体途径凋亡,抑制黑色素瘤B16细胞生长。综上所述,B16细胞中上调UT-B表达水平后,通过激活p53,来抑制糖代谢与脂代谢和诱导线粒体途径凋亡抑制黑色素瘤B16细胞生长和增殖,促进其死亡。我们已经证实了UT-B在皮肤黑素瘤发展中的作用,为黑色素瘤的治疗提供新的策略。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.5
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本文编号：
2783160
