自噬与人皮肤成纤维细胞光损伤及光老化关系的研究

发布时间：2020-08-07 18:24

【摘要】： 细胞的自稳是通过对细胞内成分合成和降解的精确调节而实现。细胞内降解物质的途径有两类,一类是蛋白酶体途径,主要降解短寿命蛋白质,还有一类就是自噬途径,主要降解长寿命蛋白质及细胞器。自噬存在于所有的真核细胞中,它对于保持细胞内环境稳定很重要。自噬可分为三类:巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaprone mediated autophagy)。巨自噬是胞浆内成份进行循环的主要途径,通常所说的自噬就是指巨自噬。大量证据证明,自噬功能会随着年龄增长而衰退,这种衰退可能是由于年龄相关的细胞结构改变及功能下降所致。研究发现,自噬在生物体的老化过程中起着关键作用。而皮肤组织作为生物体有机整体的一部分,其老化也可能与自噬有关,另外,皮肤的老化程度受紫外线(UV)照射所致光老化的影响。从信号转导途径分析,UV可能通过活化PI3K/AKT/mTOR途径或者通过抑制紫外线抵抗相关基因(UVRAG)来下调自噬表达。本研究初步探讨了UVB对人皮肤成纤维细胞自噬功能的影响,并通过人为诱导细胞自噬变化,观察人皮肤成纤维细胞活性及分泌MMP(基质金属蛋白酶)-1和MMP-3水平的相应变化,讨论自噬在皮肤光老化进程中的作用,并探索引发光老化的一种新的机制。全文分为三个部分: 第一部分UVB光损伤对人皮肤成纤维细胞自噬功能的影响 通过MDC[单丹(磺)酰戊二胺]法检测,发现UVB导致的急性光损伤在100m J/cm~2、200 m J/cm~2剂量组会引起人皮肤成纤维细胞自噬表达的上调,与正常对照组存在显著差异(p＜0.01),随着照射剂量进一步加大至300 m J/cm~2、400m J/cm~2,细胞形态发生变形、皱缩,其自噬表达水平高于正常对照组(p＜0.05),但较100 m J/cm~2、200 m J/cm~2剂量组有一定程度的下降(p＜0.05)。同时观察了200 m J/cm~2UVB照射后12、24、48h各不同时间点细胞自噬的表达,发现随着时间推移,被激活的自噬功能逐渐发生下降,各组之间差异具有显著性(p＜0.01)。结论:轻中度的光损伤可以上调自噬水平,而重度的光损伤则可严重影响细胞的形态,并出现一定程度自噬水平的下调;被急性光损伤激活的自噬功能随着时间的推移会逐渐恢复正常水平。 第二部分UVB诱导人皮肤成纤维细胞光老化对自噬功能的影响研究 通过UVB重复照射制造光老化人皮肤成纤维细胞模型,显微镜下发现,光老化细胞的形态发生明显变化,细胞增殖停滞。用半乳糖苷酶测定法检测发现光老化细胞与正常对照组相比蓝染的老化细胞明显增多,二组之间差异存在显著性(p＜0.01)。同时,细胞的自噬水平也明显下降,差异同样具有显著性(p＜0.01),其自噬的下降水平与其老化程度相一致。结论:光老化人皮肤成纤维细胞的自噬表达较正常细胞明显下降,其下降程度与细胞老化程度相关。 第三部分细胞自噬功能的变化与光老化的关系研究 通过自噬诱导剂雷帕霉素和自噬抑制剂3-MA处理,检测人皮肤成纤维细胞自噬体的表达后发现,随着雷帕霉素浓度的上升,自噬的表达呈现同步上调;而3-MA浓度增加时,则自噬的表达呈相应下降趋势。用MTT法分别检测细胞的活性后发现,自噬表达轻度增高时能提高细胞的活性,与正常对照组相比有显著差异(p＜0.01),而表达显著增高时活性反而降低,当自噬表达较正常明显降低时,细胞的活性则呈相应的下降,与正常对照组相比有显著差异(p＜0.01)。用ELISA方法检测细胞MMP-1和MMP-3的水平后发现,随着自噬表达的下调,细胞MMP-1和MMP-3的水平上升,与正常对照组存在差异(p＜0.05)。适度上调自噬表达后,MMP-1和MMP-3的水平与正常对照组差异不显著(p＞0.05),自噬表达显著升高时,MMP-1和MMP-3的水平则有明显上升,与正常对照组相比有显著差异(p＜0.01)。结论:抑制自噬的表达可以降低人皮肤成纤维细胞的活性,并加速细胞老化;适度上调自噬的表达可以提高人皮肤成纤维细胞的活性,对细胞老化的影响尚不明确;自噬表达显著上调时,人皮肤成纤维细胞的活性降低,加速细胞老化。
【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R751
【图文】：

内形成小的自噬泡，然后逐渐扩大，其边缘逐渐融合，形成完整的双层膜结构的自噬体与细胞内物质隔开，接着自噬体与溶酶体发生融合，形成自噬溶酶体来吞入待降解物质后与其内层膜一起降解(图1)。日叹协以曰.L州瀚。，..0.\、、尸2.与几、，气登白一O向栩如娜扣娜介呻.日.dinl.峋，2碱勾卜峋 16L.L口.PE图1自噬体的形成过程示意图(摘自Elisabetta民rraro， RaneeseoCeeeoni.Autophagie andaPoPtoticresPonsetostresssignalsinmanllnalianeells.ArchivesofBioehe而stry andBioPhysies，2007，462，210一219)自噬正常情况下在细胞内呈低水平表达

可明显上调细胞自噬。另外，细胞自噬功能同时受到m型PI3K的调节，其可上调自噬功能l5]。PI3K的抑制剂，如3一A、握曼青霉素、LY294002等可明显抑制自噬功能(图2)。InSUlin/!GF图2自噬细胞信号转导途径示意图(摘自wullse址egers，LoewithR， HauMN.ToR signalingingrowthandmetabolism.Cell.200610:124(3):471名4)自噬可以更新细胞内结构，使细胞年轻化，因此其在老化过程的作用越来越受到重视。研究己经发现，对所有物种，间断禁食均可以提高寿命，饮食控制使寿命延长的过程中，自噬的活化至关重要。实验证明，在控制小鼠摄入量后，小鼠体细胞自噬体显著活跃而出现明显的抗衰老效应，但让其任意进食则会通过升高氨基酸和胰岛素血浆浓度，抑制自噬，从而加速其衰老进程l6]。对蠕虫的研究

通过上述消化法获得的人皮肤成纤维细胞贴壁后形态呈长梭形，显微镜下折光性良好。细胞生长较为旺盛，约3至5天传一代，传至巧代之前未见明显的活力下降(如图3)。

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本文编号：2784352