质粒在衣原体胃肠道定植中的作用及其对生殖道致病的影响

发布时间：2020-08-13 17:28

【摘要】：沙眼衣原体泌尿生殖道感染是近年来国内外最常见的性传播疾病,绝大部分患者症状隐匿,不易被发现,导致沙眼衣原体在宿主体内持续感染,引起一系列严重的并发症和后遗症。因沙眼衣原体的小鼠动物模型不稳定,而鼠衣原体与沙眼衣原体的生物学性状相似,感染后引起的病程及临床症状、病理改变等均和沙眼衣原体相同,故本课题以鼠衣原体作为研究菌株,小鼠作为动物模型,来进一步研究沙眼衣原体在人类的致病机制。新近的研究提示衣原体除了能感染泌尿生殖道外还能够感染胃肠道并且持续存在,其携带的隐蔽性质粒可能对生殖道的致病和慢性纤维化的严重程度有重要影响。然而,衣原体在胃肠道感染定植的机制及生物学医学意义仍不清楚,质粒在胃肠道衣原体感染中所起的作用也不清楚,各种质粒编码基因在衣原体胃肠道感染中都起着什么作用也不清楚。对这些问题的深入研究和探讨,对阐明衣原体在胃肠道和生殖道感染的相互关联与影响有着重要作用。目的研究衣原体质粒及质粒编码基因在衣原体胃肠道感染定植的作用及其对生殖道致病性的影响。方法构建小鼠动物模型,C57BL/6J(n=70)和CBA/J(n=35)小鼠,阴道、静脉、直接胃肠感染接种含有质粒和质粒缺失的鼠衣原体,间接免疫荧光法检测阴道及直肠拭子中脱落细胞中的排菌量,观察不同的接种途径下,含有质粒的或者不含质粒的鼠衣原体在鼠生殖道和胃肠道的感染传播情况及入血后的感染情况;感染56天处死老鼠,观察生殖道的大体和显微镜下组织病理,观察肠道及肠外的组织病理变化;用Wilcoxon rank sum test比较含有质粒和不含质粒衣原体感染小鼠后各个时间点拭子中病原菌数量(IFUs),基因拷贝数及感染率“曲线下面积”,用Fisher’s exact test分析两组之间致病的严重性。纯化实验室前期已经构建好的不同质粒编码基因缺失的衣原体EBs,CBA/J(n=35)小鼠阴道感染接种及C57BL/6J(n=35)小鼠直接灌胃接种,检测阴道及直肠拭子中脱落细胞的排菌量,感染56天或者63天处死老鼠,观察生殖道的大体和显微镜下组织病理,比较不同质粒编码基因在生殖道的致病性作用及胃肠道衣原体感染与生殖道致病的相关性,明确这些质粒编码基因在生殖道和胃肠道的感染定植作用。质粒编码基因pgp3缺失的鼠衣原体CM-pgp3S在C57BL/6J(n=20)小鼠宫颈内、卵巢囊内感染及联合胃肠道感染,感染56天后处死小鼠观察生殖道输卵管积水的严重程度。在C57BL/6J(n=10)和My D88基因敲除(My D88 KO,n=10)小鼠宫颈内和卵巢囊内感染接种鼠衣原体,感染后3天及14天处死小鼠,生殖道组织分段匀浆,间接免疫荧光法检测各组织中带菌量,进一步证明宫颈及子宫输卵管结合部在衣原体上行感染过程中屏障作用。pgp3作为衣原体致病性的毒力因子,质粒编码基因pgp3缺失的鼠衣原体CM-pgp3S阴道内及灌胃感染My D88-/-(n=15)、CRAMP-/-(n=8)基因敲除小鼠,间接免疫荧光法检测阴道及直肠拭子中脱落细胞中的排菌量,观察这些基因敲除小鼠能否恢复pgp3缺失的鼠衣原体在胃肠道及生殖道的定植。生殖道及胃肠道组织分段匀浆,间接免疫荧光法检测各组织中带菌量,检测衣原体在生殖道及胃肠道的分布情况,进一步明确My D88及CRAMP在抗病原微生物感染中的作用。结果1.含有质粒的鼠衣原体能够从生殖道传播至胃肠道,并且能够在胃肠道爆发性生长,在生殖道引起了严重的输卵管积水;而质粒缺失的鼠衣原体从鼠生殖道传播到胃肠道显著延迟并降低,不能像含有质粒的衣原体一样,在胃肠道很容易感染定植,同时不能引起生殖道输卵管积水(p0.05)。即使通过静脉内感染或胃内直接感染接种,质粒缺失的鼠衣原体也明显不易或不能定植胃肠道。这些发现显示衣原体质粒对衣原体在胃肠道的适应和生存有重要作用,同时也显示衣原体阴道感染后,衣原体质粒在促进其在生殖道上行感染的重要作用。2.在鼠衣原体质粒编码基因中,pgp3与pgp4起着主要作用:质粒编码基因pgp3或者pgp4缺失的鼠衣原体不能在胃肠道定植,在生殖道不致病,也不能引起严重的输卵管积水。质粒编码基因pgp3缺失的鼠衣原体CM-pgp3S卵巢囊内感染接种后,同时与胃肠道给予含有质粒的衣原体感染后,增加了CM-pgp3S生殖道的致病性,提示衣原体所造成的生殖道慢性纤维化的致病性,不仅需要病原体上行感染于输卵管/卵巢造成足够的破坏,还可能依赖与胃肠道提供给生殖道致病的第二信号,即肠道依赖的致病性。pgp3缺失的鼠衣原体不能在胃肠道定植,也可能与其处于持续感染状态有关。质粒编码基因pgp5、pgp7、pgp8没有显示出与pgp3和pgp4的重要作用:质粒编码基因pgp5、pgp7、pgp8缺失的鼠衣原体在胃肠道的感染没有明显减弱,与含有质粒的鼠衣原体类似,相对应的它们在生殖道的致病性同它们在胃肠道感染能力强弱一致。3.鼠衣原体在My D88基因敲除小鼠无论是生殖道还是胃肠道的感染都是增强的,即使是pgp3缺失的鼠衣原体在胃肠道定植和生殖道的感染也是增加的。My D88的作用是维持宫颈及子宫输卵管结合部正常屏障作用,由此证实了固有免疫在宿主防御衣原体入侵的作用,宫颈及子宫输卵管结合部屏障作用降低了衣原体在生殖道的上行感染。结论衣原体携带的隐蔽性质粒在衣原体胃肠道的定植中有重要作用,甚至比在生殖道更重要,不仅能促进在生殖道的致病性,而且通过定植产生的病理性免疫促使衣原体生殖道感染所致的慢性纤维化。其中pgp3是衣原体质粒编码基因最重要的毒力因子,不仅在衣原体胃肠道的感染定植和生殖道的致病上有重要作用,而且可破坏My D88所起到的天然屏障作用进而使得衣原体在生殖道上行感染,并且能够在胃肠道定植,从另一个层面也反映了肠道微环境对机体的重要作用。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R759
【图文】：

衣原体,生长周期

使越来越多的科研工作者投身于其致病机制、新药研发及疫苗研制等的研究中。由于Ct与普通的病毒和细菌不同，在宿主细胞内繁殖有独特的两相生长周期（图1），其中原体(Elementary Body ,EB)无代谢活性但具有传染性；网状体(Reticulate Body ,RB）或称始体代谢活跃，以二分裂方式进行繁殖，无传染性，这些特殊的生物学特性使得抗生素的治疗效果并不令人满意，其治疗失败的机制至今尚未研究清楚。很多研究团队把精力投入到了Ct预防性和治疗性疫苗的研制当中，包括蛋白疫苗、多肽疫苗、亚单位疫苗，甚至DNA疫苗，但迄今为止尚未研制出具有有效免疫保护作用的疫苗。

衣原体,外成,内体,后体

图2：经阴道感染 luciferase-expressing 鼠衣原体后体内体外成像及各组织器官的衣原体分布（Qizhang,et al.Infection and immunity,2015）课题组研究(图2)[27]发现生殖道鼠衣原体感染后能够传播到胃肠道，并在胃肠道长期持续存在，这为研究胃肠道衣原体的感染在衣原体致病中的作用奠定了基础，有助于进一步研究衣原体的致病机制及生殖道衣原体传播到胃肠道的

衣原体,脱落细胞,包涵体,蓝色

图 1:显微镜下观察小鼠脱落细胞及组织中衣原体含量及包涵体形态，蓝色显示Hela 细胞核，绿色荧光显示为鼠衣原体包涵体1.2.2 纯化的 CM EB 浓度取-80℃冰箱冻存的 EB，用 SPG 缓冲液倍比稀释，分别感染 24 孔板盖玻片上培养的单层 Hela 细胞，间接免疫荧光染色，荧光显微镜下不同视野、不同稀释倍数、不同放大倍数下的衣原体包涵体形成单位（IFUs）计数结果如下（表1-1）；

【参考文献】