小胶质细胞与外伤后细菌性致死性肉芽肿病原菌—痤疮丙酸杆菌相互作用研究

发布时间：2020-08-14 09:14

【摘要】： 外伤后细菌性致死性肉芽肿(fatal bacteria granuloma after trauma,FBGT)是一种继发于面部外伤的慢性感染性致死性疾病,目前已明确其病原菌为痤疮丙酸杆菌(P.acnes),且已证明从患者皮损内分离出的细菌并非高毒力变异株。P.acnes是一种革兰阳性厌氧杆菌,属于一种低毒力细胞内寄生菌。FBGT患者均在皮损出现1.5至4年后死于由P.acnes导致的脑组织炎症。小胶质细胞(microglia,MG)是宿主颅内的重要免疫细胞,它可分泌细胞因子促进颅内的炎症反应和免疫应答。研究病原菌与宿主颅内免疫细胞之间相互作用,可能有助于在一定程度明确FBGT发病机理,为后续研究打下基础。 在本研究中,我们以病原菌与宿主颅内免疫细胞—MG之间的相互作用为立足点,并在此基础上通过MTT法、ELISA法、PCR法、流式细胞术等 方法,探讨宿主的颅内免疫细胞-MG在P.acnes入侵后在增长、吞噬以及分泌细胞因子等方面改变,期望明白MG和P.acnes的免疫应答模式,以阐明FBGT的部分发病机制。 1.光镜和电子显微镜观察细胞形态学变化。 2. P.acnes对MG增殖和凋亡的影响以及MG吞噬变化。 FBGT病原菌以不同浓度和不同时间作用于MG ,采用甲基噻唑基四唑(MTT)法检测细胞活性,观察P.acnes对MG增殖的影响。流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期,观察MG被P.acnes刺激后细胞的凋亡情况。 3. P.acnes对MG产生TNF-α、IL-1β的影响 以病原菌株和P.acnes标准菌株及相应灭活菌菌悬液,按照不同分组,作用于MG24小时后,用RT-PCR的法、ELISA法比较P.acnes作用MG后,在蛋白水平、mRNA水平上细胞产生TNF-α、IL-1β的差别。 结果: 1.倒置显微镜观察MG传代后贴壁生长,呈梭形或三角形,排列紧密,核分裂像多;和P.acnes共孵育后,大部分细胞变圆,部分细胞聚集成团,细胞周围有空晕。电镜下显示MG表面有微绒毛,MG胞质中溶酶体增多现象,与P.acnes作用18h后,可见MG胞膜内陷,包绕吞噬细菌,边缘清晰。 2.P.acnes对MG增殖和凋亡的影响: MG和P.acnes共孵育,分别持续8h和16h,发现其细胞活力受到明显抑制。实验组与对照组存在显著差异,各实验组(即P.acnes活菌组1、2、3、4组)之间有统计学差异(P0.05),P.acnes对MG活力的抑制呈时间和剂量依赖性,空白组、灭活组与实验组的MG均出现一定数目的凋亡细胞,但实验组与各对照组有显著性差异(P0.05),各对照组间无显著性差异。各对照组的MG周期无明显变化,细胞凋亡率随着孵育时间的延长而呈上升趋势。 3. P.acnes对MG产生TNF-α、IL-1β的影响 P.acnes临床株和标准株均可促进MG产生TNF-α和IL-1β,与空白对照组相比有统计学意义(P0.05)与相应的灭活菌对照组差别无统计学意义。 结论: 1.外伤后细菌性致死性肉芽肿病原菌P.acnes可抑制MG的生长,诱导MG调亡,可能和患者的病原菌入颅病原菌持续存在,不被MG所杀灭,与其后导致的炎症反应密切相关。 2.P.acnes均可促进MG产生TNF-α、IL-1β,提示P.acnes刺激机体早期免疫应答,可能在一定程度造成对中枢神经系统的免疫损害。 3.本研究探讨了P.acnes和MG的相互作用特点,为深入研究FBGT发病及致死机制打下一定基础。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R758.733
【图文】：

和大肠杆菌共孵育18小时[×200].3.2 电镜观察与P.acnes作用18h后，可见MG胞膜内陷，包绕吞噬细菌（见图2-A,B)，细胞质内可见被溶酶体膜包绕的细菌，边缘清晰[图2-C]。-37-A B C图2：电镜下观察MG吞噬P.acnesA:MG 吞噬P.acnes的过程（×20k）; B: MG 吞噬灭活的P.acnes的过程（×5k）; C: P.acnes被吞噬时特有的细菌的结构（×20k）。

倒置显微镜观察:MG传代后贴壁生长，呈梭形或三角形，排列紧密，核分裂像多；和P.acnes共孵育后，大部分细胞变圆，部分细胞聚集成团，细胞周围有空晕（图1-A,B），可见MG吞噬灭活的P.acnes（图1-C）,可见吞噬的E.coli，（图1-D）。-36-A B

图 3 TNF-α、IL-1β 的 RT-PCR 电泳图 对 MG 产生 TNF-α 和 IL-1β 分泌的影响s作用于MG 24 h时，TNF-α、IL-1β表达量均有明显增加准株灭活组与空白对照组的差别无统计学意义。标准-α表达量高于临床株作用的细胞，而标准株刺激MG表床菌株，但无统计学意义。（表3）-45-

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本文编号：2792824