5-氟尿嘧啶对体外培养正常皮肤及瘢痕疙瘩成纤维细胞作用机制的实验研究

发布时间：2020-09-14 18:41

　　目的应用体外培养人正常皮肤(normal skin, NS)及瘢痕疙瘩(keloid)成纤维细胞模型,观察MEK/ERK信号通路特异性抑制剂5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU,PD98059)对两组细胞的增殖、凋亡及部分生物学功能的影响,以及5-FU作用后细胞内MEK/ERK信号通路中多个相关信号蛋白分子活化的变化情况,探讨5-FU对正常皮肤及瘢痕疙瘩成纤维细胞的生物学作用,以及MEK/ERK信号转导途径在瘢痕疙瘩形成中的作用机制,为瘢痕疙瘩形成的机制研究以及临床应用5-FU治疗瘢痕疙瘩提供实验依据。方法收集人体的正常皮肤以及瘢痕疙瘩组织,应用组织块法分离原代培养瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblast,KFB)及正常皮肤成纤维细胞(normal skin fibroblast,NSFB),进行成纤维细胞鉴定及绘制生长曲线；各组细胞经浓度分别为(0.1g/L,0.25g/L,0.5g/L,1.0g/L,2.0g/L)的5-FU作用48h后,甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测细胞增殖及成纤维细胞半数抑制浓度(IC50值)；选用3个5-FU浓度分别为(0.25g/L,0.5g/L,1.0g/L),做为以下实验的浓度；流式细胞术检测细胞周期；TUNEL法检测细胞凋亡；Western Blot法检测5-FU作用后MEK/ERK信号转导通路中信号蛋白分子MEK1、MEK1/2磷酸化蛋白的表达变化。结果 1.5例手术切取的瘢痕疙瘩和2例正常皮肤标本组织,原代培养成纤维细胞全部成活,细胞生长良好,融合成片,形态正常。 2.倒置显微镜下观察成纤维细胞的形态,呈梭形、长条形,少数多角形或不规则形,1-2天即呈融合状态。成纤维细胞波形蛋白免疫细胞化学染色,显示成纤维细胞胞浆内见大量棕黄色颗粒,核为蓝色。 3.通过生长曲线比较,第1-2天两组细胞为滞留期；第3-6天为对数生长期；第6天以后,为平台期。在相同生长环境下,瘢痕疙瘩培养出的成纤维细胞同正常皮肤相比,其增殖速度较快。 4.MTT检测,各组细胞经浓度分别为(0.1g/L,0.25g/L0.5g/L,1.0g/L,2.0g/L)的5-FU作用48h后,随着药物浓度的升高OD值逐渐降低,各组细胞的增殖均受到抑制(P0.05),表明药物对细胞的作用存在剂量—效应关系。各组成纤维细胞半数抑制浓度(IC50值)分别为正常皮肤组(1.237士0.041)g/L,瘢痕疙瘩组(0.530士0.032)g/L。 5.各组成纤维细胞经不同浓度5-FU作用48小时后,随药物浓度的增加,KFB与对照组相比G0-G1细胞比例逐渐下降,S期细胞数量比例增加,G2-M细胞数量增加(P0.05)；而NSFB与对照组相比G0-G1细胞比例逐渐下降(P0.05)。表明细胞大部分被阻滞在G1期,细胞分裂受到抑制。 6.两组细胞在荧光显微镜下可见TUNEL阳性信号为强绿色荧光,位于胞核内,呈小圆形、环行或小颗粒聚集状。对照组成纤维细胞可见少量凋亡细胞,而各实验组的凋亡细胞数量随药物浓度的提高而上升,与对照相比具有非常显著性差异(P0.01)。 7.经不同浓度5-FU作用48小时后,两组细胞的MEK1及MEK1/2蛋白表达均低于对照组,且随药物浓度的提高而降低(P0.05)。结论 5-FU能有效的诱导成纤维细胞细胞凋亡,抑制细胞增殖,该药物具有明显的抗瘢痕作用；5-FU可能通过干扰MEK/ERK信号转导途径,发挥抗瘢痕作用。MEK/ERK信号转导途径在瘢痕疙瘩的形成中发挥重要作用。
【学位单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2013
【中图分类】：R751.05

【参考文献】