应用Genomewide短链非编码RNA文库筛选维罗非尼耐药黑色素瘤细胞及其机制初步探讨

发布时间：2020-09-14 19:23

　　目的:恶性黑色素瘤最常见的遗传学改变是BRAF V600E突变,针对该突变开发出的BRAF抑制剂维罗非尼是治疗恶性黑色素瘤的一线药物,但是该药在临床治疗过程中普遍产生耐药性,其机制尚未完全阐明。为探索该耐药机制,我们拟构建覆盖全基因组的短链非编码RNA(50碱基)文库,运用该RNA文库快速筛选获得维罗非尼耐药黑色素瘤细胞,并通过利用该耐药细胞模型及高通量测序等手段探索黑色素瘤耐药新机制,为寻求新的治疗靶点提供理论依据。方法:以逆转录病毒骨架pSEB-61d质粒为载体,利用RNA聚合酶III依赖的U6启动子精确控制系统,通过化学法合成50碱基随机排列的引物,利用该引物PCR扩增含50碱基随机排列的双链DNA作为Gibson Assembly的插入片段,将该PCR产物片段在U6启动子下方通过Gibson Assembly方法构建short regulatory RNA(srRNA)文库,命名为pSEB-U50文库,并对该方法进行文库构建克隆阳性率、覆盖率等方面的鉴定。将pSEB-U50文库质粒包装成逆转录病毒、感染伴有BRAF V600E突变的黑色素瘤细胞A375,Mel-888,再通过致死剂量的维罗非尼筛选建立耐药黑色素瘤细胞模型。提取文库筛选耐药细胞基因组DNA,特异性扩增出包含50碱基的片段用于Illumina HiSeq平台测序,试图找到耐药细胞富集的50碱基片段,并利用qPCR检测耐药细胞中耐药相关基因的表达。为探讨pSEB-U50文库筛选出的耐药细胞自噬发生的变化情况,设计并构建了自噬流监测腺病毒Ad-mRFP-EGFP-LC3,成功应用于耐药细胞的自噬流的监测,同时应用了其他细胞模型和动物实验对该腺病毒的体内外自噬流的监测进行评价。结果:(1)应用Gibson Assembly构建pSEB-U50文库具有高效性,一次组装文库质粒数约为2.5×10~6,并且由于在载体质粒中引入了细菌自杀基因ccdB,成功地提高了文库构建时克隆阳性率,达到95%以上。将随机挑选的20个阳性克隆经质粒提取后进行测序,发现文库质粒中插入的50碱基片段没有重复,说明该文库具有多样性及高覆盖率。(2)在2%浓度血清培养条件下,维罗非尼作用于A375的致死剂量为10uM;Mel-888的致死剂量为15uM。(3)感染逆转录病毒pSEB-U50短链非编码RNA文库的A375、Mel-888细胞,使用致死剂量的维罗非尼进行耐药筛选,结晶紫染色结果表明,感染了pSEB-U50短链非编码RNA文库的A375,Mel-888细胞在高达30uM的药物浓度情况下可以存活,证实成功筛选出了文库作用后的耐药黑色素瘤细胞。(4)流式细胞周期结果显示:与亲代细胞相比,A375U50V细胞对维罗非尼有较好的细胞耐受能力。在维罗非尼作用下,A375U50V细胞S期+G2期细胞比例从(7.11%+30.24%)37.35%变化至(8.47%+28.04%)36.51%,而亲代细胞的S期+G2期细胞比例由(7.08+18.62%)25.7%下降到(0.68%+0.95%)1.63%,说明在5uM维罗非尼作用下,亲代细胞的增殖已明细抑制,而耐药A375U50V细胞周期未受影响。(5)使用Tq-PCR检测A375亲代细胞及文库筛选的耐药细胞A375-U50V,及其它们在低浓度维罗非尼作用下的细胞中耐药相关基因的表达,发现耐药细胞A375-U50V在低浓度维罗非尼作用24h后,多重耐药基因、EMT相关基因、肿瘤干性相关基因、细胞自噬相关基因表达显著升高。(6)成功构建了腺病毒Ad-mRFP-EGFP-LC3,应用于A375亲代及A375-U50V自噬的检测,发现耐药细胞中自噬活性增加,与自噬基因表达增加相一致;并且腺病毒Ad-mRFP-EGFP-LC3应用于其它细胞及体内实验证实:该病毒可成功监测自噬流中自噬小体形成、自噬小体与溶酶体融合,表现为观察到细胞浆中绿色颗粒消失,红色颗粒不变的情况。结论:本研究以BRAF V600E突变细胞A375、Mel-888为细胞模型,通过导入自建的逆转录病毒pSEB-U50短链非编码RNA文库、致死剂量维罗非尼药物快速筛选、结晶紫染色、流式细胞术及q-PCR等实验,成功得到文库筛选后的耐药黑色素瘤细胞,并且发现该耐药机制可能与细胞自噬增加、EMT及肿瘤干性等相关;另外,成功构建了自噬监测腺病毒Ad-mRFP-EGFP-LC3及体内外实验成功得到应用。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R739.5
【部分图文】：

示意图,原理,示意图,多片

在 5’核酸外切酶、T4 DNA 连接酶和 DNA 合成酶作用下（作用过程参见图1.1）， 50 ℃水浴 15～60 分钟，随后将产物用于进行细菌转化，整个定向克隆过程完成。该方法具有如下优点：（1）简单、快速和高效；（2）几乎可以向任何载体在任何位点（具有酶切位点可以用于线性化质粒）进行定向克隆；（3）不需要考虑插入片段本身具有的酶切位点的影响；（4）可用于多片段，最高达 15 个片段的同时连接，片段长度可达 100bp～10kb。经典的 DNA 定向克隆方法主要是使用限制性内切酶酶切、T4 DNA 连接酶连接来进行，但该方法存在一些缺点，主要包括：受连接片段内酶切位点限制、多片段连接时需要对每个片段单独进行处理，操作步骤增多等，而采用 Gibsonassembly 方法可以克服这些缺点。因此，我们选择 Gibson assembly 方法来构建随机短链非编码 RNA 文库。本课题以逆转录病毒质粒 pSEB-61d 为载体（见图 1.2），在 U6 启动子下方某段位置以化学法合成随机 50 个碱基的小 RNA 片段

质粒图谱,原理,示意图

图 1.1 来自于 NEB 公司的 Gibson Assembly 原理示意图Figure1.1 Gibson assembly overview from NEB

菌落计数,文库,单次,菌落数

重庆医科大学博士研究生学位论文on Assembly 随机短链非编码 RNA 文库质粒菌落计数一次组装的文库质粒 100ul,取 10ul 电转化入 DH10B 感受态细 500ul LB 稀释，取 5ul 用于 Amp LB 涂板，在细菌培养箱中落长到一定大小后，进行菌落计数及拍照。如图 1.3 所示，该500 个，因为是稀释 1000 后所得菌落数，那么一次 Gibson Ass数目大约为：2500×1000=2.5×106。本文库构建时共重复进行embly,因此本文库所含的菌落数大约为 3.25×107。该文库的菌n Assembly 次数增加可继续增加。（图 1.3）。1:1000 稀释

【参考文献】