NOS1通过亚硝化HDAC2抑制黑色素瘤细胞干扰素反应性

发布时间：2020-09-14 20:14

　　研究背景和目的IFNα与细胞表面的受体结合后诱导干扰素刺激基因(ISGs)表达来发挥抗增殖,促凋亡,抗病毒等作用。去乙酰化酶(HDACs)通常与转录抑制相关,但I型HDACs(HDAC1,2,3)却是细胞IFN反应性所必需的,具体的机制尚不清楚。一氧化氮(NO)由三种一氧化氮合酶(NOS1,NOS2,NOS3)催化生成,NOS在多种肿瘤中表达升高并促进肿瘤恶性进展。NO基团能与蛋白质特定半胱氨酸残基上的巯醇结合,形成亚硝基硫醇共价键,称为巯基亚硝基化(SNO),是NO发挥功能的主要方式之一。NOS/NO通过亚硝基化大量肿瘤相关蛋白调控肿瘤增殖、凋亡、血管生成和侵袭转移等功能。NO/NOS1能抑制肿瘤免疫,NOS1在黑色素瘤细胞中高表达,且NOS1降低了外周血单核细胞对IFNα的反应性,但具体的机制不清。HDAC2是NO亚硝化修饰的靶蛋白,NOS1是否通过亚硝化HDAC2参与了肿瘤细胞IFNα反应性的调控还不清楚。本课题将探讨NOS1对黑色素瘤干扰素反应性的调控作用并阐明相关分子机制,为揭示黑色素瘤干扰素治疗抵抗提供新思路。研究结果1.采用NO供体和NOS抑制剂处理黑色素瘤细胞株,初步得出NO参与了IFNα诱导的ISGs的表达调控,构建稳定过表达NOS1的黑色素瘤细胞株进行体外实验证明,NOS1抑制了 IFNα诱导的ISGs的转录和表达。2.探讨HDAC2在调控ISGs表达中的作用,利用siRNA和外源性质粒转染方法调节细胞内HDAC2的表达水平,并结合RT-PCR和pISRE荧光素酶报告基因等方法检测,表明HDAC2促进了ISGF3依赖性基因的转录和表达。利用ChIP-qPCR方法分析显示IFNα刺激诱导HDAC2向ISGs启动子区招募,使组蛋白H4K16去乙酰化,进而招募RNA聚合酶II与启动子结合启动转录,从而调控肿瘤细胞的ISGs表达,同时,HDAC2不影响H3和H4K5乙酰化。3.我们通过“Biotin-Switch”,定点突变,Co-IP等方法,进一步证实NOS1与HDAC2结合并亚硝基化HDAC2,NOS1通过亚硝化HDAC2的C262/C274位点并抑制其对H4K16的去乙酰化和RNA聚合酶II的招募,从而抑制了肿瘤细胞的ISGs表达。4.通过稳定过表达NOS1的小鼠黑色素瘤细胞尾静脉注射方式构建小鼠肺转移模型,结果表明NOS1可以促进小鼠黑色素瘤肺转移,在过表达NOS1细胞中转入HDAC2点突变质粒能逆转NOS1的作用;黑色素瘤细胞中敲除HDAC2抑制了小鼠肺部肿瘤形成,在敲除HDAC2的细胞中稳定表达野生型HDAC2和突变型HDAC2均可以恢复黑色素瘤肺部肿瘤形成,且HDAC2突变后部分程度上逆转了黑色素瘤肺转移。研究结论NOS1抑制黑色素瘤细胞干扰素诱导的ISGs的转录和表达,IFNα刺激招募HDAC2到ISGs启动子区并使组蛋白H4K16去乙酰化,促进了 RNA聚合酶II与启动子的结合从而促进ISGs的转录和表达。NOS1通过亚硝基化HDAC2抑制其功能从而抑制了黑色素瘤干扰素反应性并促进肿瘤进展,本课题为靶向NO/NOS1治疗肿瘤提供了线索和理论依据。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R739.5
【部分图文】：

酵母,人类,结构域,转录抑制

ＨＤＡＣ８主要存在于细胞质中，并在平滑肌分化的细胞中表达｜３４１。Ｉ类ＨＤＡＣ的逡逑蛋白质结构的特征在于高度保守的脱乙酰酶结构域，其侧翼为短氨基和羧基末逡逑端延伸（图１）。Ｉ类ＨＤＡＣ作为多蛋白复合物的一部分被募集并靶向基因以介逡逑导转录抑制，ＨＤＡＣ１和ＨＤＡＣ２是Ｓｉｎ３，Ｍｉ－２／ＮｕｒＤ和ＣｏＲＥＳＴ复合物的催化逡逑亚基，而ＨＤＡＣ３主要由Ｎ－ＣｏＲ／ＳＭＲＴ复合物募集，到目前为止，ＨＤＡＣ８尚未逡逑被报道为任何蛋白质复合物的成员［３５１。逡逑与Ｉ类ＨＤＡＣ不同，Ｉｌａ类ＨＤＡＣ以组织特异性方式表达，并参与分化和发逡逑育过程，它们在骨骼，平滑肌，免疫系统，心血管系统和大脑中发挥其转录抑制逡逑功能。Ｉｌａ类ＨＤＡＣ的一个特点是具有较长的调节性Ｎ－末端结构域，介导与组织逡逑特异性转录因子和共抑制因子的相互作用氨基末端结构域含有高度保守的逡逑丝氨酸残基，可以被磷酸化修饰。Ｉｌａ类ＨＤＡＣｓ的信号依赖性磷酸化，是决定它逡逑们是否位于细胞核或细胞质中的关键因素，因此，它们在核区室中作为转录共抑逡逑制因子存在。尽管Ｉｌａ类ＨＤＡＣ具有高度保守的组蛋白脱乙酰化酶结构域

抑制剂,黑色素瘤,细胞

提取总的ＲＮＡ。利用ＲＴ－ＰＣＲ技术，我们检测了黑色素瘤Ａ３７５细胞中ＩＦＮａ诱逡逑导的邋１０邋个邋ＩＳＧｓ邋（ＩＲＦ７，ＩＳＧ１５，ＩＳＧ５４，ＩＳＧ５６，ＳＯＣＳｌ，ＩＦＩ２７，ＩＦＩＴＭ３，ＯＡＳ３，ＭＸｌ，逡逑ＩＲＦ３）的ｍＲＮＡ表达情况。结果显示（图１－３Ａ，邋Ｂ），与加了干扰素却未加抑制逡逑剂的对照组相比，加入ＮＯＳｓ抑制剂（Ｌ－ＮＡＭＥ或Ｎ－ＰＬＡ）均可增加ＩＦＮａ诱导逡逑的ＩＳＧｓ表达。其中，ＮＯＳ泛抑制剂Ｌ－ＮＡＭＥ处理细胞后能诱导８个ＩＳＧｓ表达逡逑升高，具有统计学差异（Ｐ值见表１－６Ａ），邋ＳＯＣＳ１，ＯＡＳ３升高不明显；而ＮＯＳ１逡逑特异性抑制剂Ｎ－ＰＬＡ作用细胞后能诱导ＩＳＧｓ表达增加１－２倍，７个ＩＳＧｓ表达逡逑均升高，具有统计学意义（表１－６Ｂ），邋ＩＦＩ２７，邋ＩＦＩＴＭ３，邋ＩＲＦ３升高不明显，没有逡逑统计学差异。这提示黑色素瘤Ａ３７５细胞中的内源性ＮＯ参与抑制了邋ＩＦＮａ诱导逡逑的ＩＳＧｓ的表达，并且三个ＮＯＳｓ亚型可能均参与了肿瘤细胞ＩＦＮａ的反应性的逡逑调控，因为Ｎ－ＰＬＡ和Ｌ－ＮＡＭＥ对ＩＳＧｓ表达调控的程度相当，我们考虑其中逡逑ＮＯＳ１可能是参与调控ＩＳＧｓ表达的主要亚型

过表达,蛋白,细胞,方法

组和过表达ＮＯＳｌ邋（ｏｖｅｒ－ＮＯＳｌ）的Ａ３７５，邋ＳＷ４８０，邋ＳＫ０Ｖ３细胞中加入或不加ＩＦＮａ逡逑处理６小时，１２小时，提取细胞总ＲＮＡ后用ＲＴ－ＰＣＲ方法检测了邋１０个ＩＳＧｓ的逡逑表达。结果显示（图１－６），与未加干扰素刺激的对照组细胞相比，加了干扰素处逡逑理的三株肿瘤细胞中，ＩＳＧｓ的诱导表达水平差异明显。其中ＳＫＯＶ３细胞对干扰逡逑素刺激最为敏感，ＩＦＮａ作用细胞后可以诱导ＩＳＧｓ表达升高１－１５０倍，其中ＩＳＧ１５，逡逑ＩＳＧ５４，邋ＩＳＧ５６，邋ＩＦＩ２７，邋ＭＸ１邋升高最为明显，ＩＳＧ１５，邋ＩＳＧ５４，邋ＩＳＧ５６邋在邋６邋小时刺逡逑激时表达水平较高，１２小时后有所降低，而ＩＦＩ２７，邋ＭＸ１在６小时刺激时表达逡逑相对较低，１２小时刺激时表达较高，表明不同基因反应时间存在不一致性。但逡逑与ＳＫＯＶ３细胞相比，Ａ３７５细胞和ＳＷ４８０细胞对干扰素刺激不敏感，ＩＦＮａ作逡逑用细胞后仅能诱导ＩＳＧｓ表达增加１到５倍，表明这三株肿瘤细胞对ＩＦＮａ反应逡逑性不同。在这三株肿瘤细胞中

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