温热及热休克蛋白对人角质形成细胞抗HPV感染的作用研究

发布时间：2020-09-23 06:26

　　目的:人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)感染是一组皮肤科临床常见疾病。作为一种接触性传播疾病,HPV感染对广大劳动人民的健康和生活质量造成了一定的损害。同时,作为一种常见的性传播疾病,HPV感染也在患者精神和社会层面上产生了诸多不良影响。因此,如何有效地阻断HPV病毒的传播,治疗HPV病毒感染性疾病成了皮肤科的一项重要临床任务。现阶段,应对HPV感染性皮肤病的传统治疗手段(如冷冻、激光、光动力疗法等)均存在治疗过程痛苦、复发率高或治疗成本高昂等缺点。而一种新兴的局部温热疗法在保证较高治愈率的前提下还具有无痛苦、低复发率、无特殊禁忌症、多位点治疗效应等优势,已成为一种良好的HPV感染替代治疗方案。本研究从温热效应和热休克蛋白对人类角质形成细胞的影响入手,进一步探索局部温热治疗HPV感染的内在机制,并为找寻温热干预靶点,提升疗效,缩短治疗周期,减少复发率等方面提供更多的思路。研究方法:本研究选用人类角质形成细胞或组织(HaCaT细胞系,包皮组织和尖锐湿疣疣体组织)作为研究对象,其中包皮组织来源于临床包皮环切术患者切除的包皮组织,尖锐湿疣疣体来源于临床行病理检查患者切除的多余疣体组织。疾病组织由病理诊断确定,相关实验方案经由中国医科大学附属第一医院伦理委员会批准。研究采用44(±0.1)℃水浴体外加热方法模拟临床温热治疗,探究温热治疗对角质形成细胞的影响。细胞或组织中蛋白质谱表达情况使用iTRAQ标记或SILAC标记的蛋白质谱检测技术进行定量;mRNA表达水平使用基于SYBR染料法的实时荧光定量PCR技术进行测定;蛋白质表达水平使用Western Blot技术进行检测;蛋白质在组织中的表达与定位情况由免疫组织化学染色技术进行测定,而在细胞中的表达与定位情况则由免疫荧光染色技术进行测定;DNA核酸检测使用琼脂糖凝胶电泳进行分离与鉴定。对于细胞功能学检测,细胞凋亡与细胞周期分布均使用流式细胞仪进行测定,而细胞增殖活性则使用MTS细胞增殖实验检测。温热及热休克蛋白对角质形成细胞蛋白质乙酰化水平的影响由TMT标记的蛋白质谱检测技术进行定量分析。统计分析方面,全部高通量数据均采用R语言(版本号3.4.1)平台进行生物信息学计算分析;蛋白质相互作用网络分析使用SRTING在线数据库和Cytoscape(版本号3.5.1)软件进行分析和绘制;细胞系来源数据均采用独立样本t检验或方差分析进行判断,而组织来源数据均采用配对t检验进行分析,检验水准均为P0.05。除蛋白质互作网络外,本研究其余图片均使用R语言(版本号3.4.1)ggplot2软件包绘制,并使用Photoshop 7.0软件拼接。结果:1)44℃温热刺激造成HaCaT细胞中630个蛋白质产生差异表达(阈值1.3,P值0.05),其中上调蛋白质251个,下调蛋白质379个。上调蛋白质依照表达量可聚为4类,参与到细胞膜质运动、凋亡、应激反应、能量代谢、病毒与宿主相互作用与病毒感染调控中。而下调蛋白可聚为5类,分别参与到多种代谢途径、病毒基因转录与表达、核糖体合成、核蛋白组装、细胞周期调控等生物学过程中。蛋白质互作分析鉴定到591个节点共6167组相互作用关系,且上、下调网络可各鉴定到4种主要互作模式,其执行功能与聚类分析结果类似。对互作网络的深入挖掘得到上、下调网络中排名前十的节点蛋白,可作为未来研究靶点。2)44℃温热刺激造成了尖锐湿疣组织中102个蛋白质产生差异表达(阈值1.2,P值0.05),其中上调蛋白37个,下调蛋白65个。对质谱结果的验证试验证实,包括OAS1在内的10种差异蛋白mRNA表达水平呈现对应变化,而包括MX1在内的4种差异蛋白的蛋白质表达水平发生对应改变。聚类和富集分析发现,上调蛋白质更多富集于抗原提呈和病毒防御反应之中,而下调蛋白主要富集于合成、分解代谢和角质形成细胞分化等过程之中。蛋白质互作网络研究发现全部差异蛋白存在49个节点共68组相互作用关系的互作网络,并可挖掘出两种主要的互作模式。由互作网络得到包含CETN2在内的13个节点蛋白质,可作为未来实验分析重点。3)44℃温热刺激在多种来源的人角质形成细胞中均可诱导热休克蛋白DNAJA4的表达,且表达情况呈现快速一过性变化,达峰时间在8小时左右,24小时可基本恢复基线水平。DNAJA4蛋白主要表达于表皮,在细胞内主要集中于胞质,且在静息状态下存在一定的基础表达量。44℃温热刺激与DNAJA4基因缺失均可造成P65蛋白质的磷酸化,并促进下游基因转录,且该活化反应可被特异性抑制剂PDTC和Helenalin所阻断。DNAJA4基因缺失降低了HaCaT细胞对44℃温热刺激的抵抗力,造成细胞死亡增加,S期比例下降,MTS增殖放缓,而这些效应可被PDTC部分阻断。4)44℃温热刺激可在多种来源的人角质形成细胞中诱导热休克蛋白HSPA6的表达,且表达亦呈现快速一过性变化,达峰时间约在4小时左右,24小时可恢复基线水平。HSPA6在静息状态下无表达或表达量极低,受温热刺激后主要表达于细胞质中。HSPA6基因缺失显著地降低了HaCaT细胞对44℃的耐受能力,造成大量细胞凋亡和死亡,细胞周期分布显著阻滞,MTS增殖活性下降。PCR芯片检测结果显示,HSPA6对人类抗病毒活性分子的转录具有双向调节现象,对不同效应的分子产生不同的作用。5)44℃温热刺激造成HaCaT细胞中240个蛋白质共计311个赖氨酸位点乙酰化修饰的改变(阈值1.5,P值0.05),其中乙酰化上调蛋白质150个(194个位点),乙酰化下调蛋白90个(117个位点),其中有11个蛋白质同时存在乙酰化上、下调改变。对乙酰化修饰位点的氨基酸基序测定分析找到了包含GKK基序在内的15种主要的乙酰化修饰基序。富集分析结果显示,乙酰化上调蛋白质主要参与到病毒基因调控和端粒组装,而乙酰化下调蛋白主要参与了P53信号转导通路和组蛋白染色质相互作用。同时,乙酰化上、下调的蛋白质均同时参与到了RNA的处理、运输、代谢等生物学过程之中。6)44℃环境下,热休克蛋白DNAJA4对HaCaT细胞中DNA调节、rRNA处理和代谢以及P53信号转导通路中的蛋白质乙酰化影响较小,而对凋亡、病毒核酸调控及mRNA剪切与代谢等过程中蛋白质乙酰化影响较大。而热休克蛋白HSPA6则对RNA剪切、处理及代谢,DNA复制,病毒复制与转录调控,以及P53信号通路等生物学过程中蛋白质的乙酰化均产生了较为明显的影响。结论:1)在HPV阴性(HaCaT)或阳性(尖锐湿疣)角质形成细胞中,44℃温热刺激均可能造成了细胞物质或能量代谢过程的阻断,抑制病毒核酸的复制或转录,同时提升了角质形成细胞的抗原提呈能力和抗病毒分子活性。这些分子变化可能是临床局部温热疗法治疗HPV感染性疾病的重要分子基础。2)热休克蛋白DNAJA4通过NF-kappa B信号通路部分阻断了44℃温热作用下HaCaT细胞凋亡、死亡比例上升,细胞周期S期下降,以及细胞增殖活性减弱的现象。3)44℃温热环境下,热休克蛋白HSPA6为HaCaT细胞提供了重要的保护作用,有效地减少了细胞凋亡、死亡比例,防止细胞周期的阻断,保护其增殖活性。同时,HSPA6还对44℃温热诱导的抗病毒活性分子产生双向调节作用。4)在HaCaT细胞中,44℃温热刺激更趋于上调抗病毒活性分子乙酰化水平,下调染色质调控相关分子乙酰化水平,而对RNA代谢相关蛋白进行双向调节,并以此调控细胞的抗病毒反应活性。而热休克蛋白DNAJA4与HSPA6均对HaCaT细胞上述生物学过程的蛋白质乙酰化产生差异性影响,且HSPA6相比DNAJA4影响力更为显著。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R759
【部分图文】：

分布图,蛋白质谱,置信度,分布图

3 实验结果1 温热刺激下 HaCaT 细胞蛋白质谱表达变化及生物信息学分析1.1 HaCaT 细胞受温热刺激后全局蛋白质谱变化检测HaCaT 细胞分别分组为实验组（44℃）和对照组（37℃），根据实验方法所程完成三次独立质谱检测。质谱结果搜库后共鉴定到 6670 个蛋白质，其中可蛋白质共 5307 个。以实验组细胞质谱表达量/对照组细胞质谱表达量计算差异倍数，设定阈值为 1.3 倍（大于 1.3 或小于 0.769），且三次独立实验进行独立 t 检验，规定统计学差异阈值为 p<0.05。最终，获得满足上述筛选条件的可定白 630 个，其中上调蛋白质 251 个，下调蛋白质 379 个。差异蛋白质丰度与置如图 1 所示。

蛋白质谱,生物信息学分析,全局

相对比对照组 HaCaT 细胞，温热处理造成了实验组细胞核糖体生物合成、RNA 代谢、蛋白质内质网定位、病毒核酸调控、细胞周期调控等生物学过程（BiologicalProcess, BP）的改变。如图 2A 所示，这些生物学过程主要涉及了 RNA 结合、核糖体结构、辅酶结合以及细胞骨架蛋白结合等关键分子功能（Molecular Function, MF）,从而影响了核糖体、胞内质膜系统、剪切体以及染色体等主要的细胞结构（CellularComponent, CC）。同时，对受温热刺激改变的全体蛋白质进行 KEGG（KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes）富集分析发现（图 2B），近似于 GO 富集分析的结论，44℃温热刺激在 HaCaT 细胞中造成了对应的信号转导通路改变。具体地，温热刺激造成了碳代谢、糖酵解与糖异生及氨基酸合成等代谢通路分子的变化；病毒致癌、人乳头瘤病毒感染在内的多种病毒感染相关生理通路分子的改变；同时也造成了诸如紧密连接在内的细胞间粘附通路，内质网蛋白质处理在内的细胞内蛋白质定位等通路分子的变化。由此可见，总体上 44℃温热刺激在 HaCaT 细胞中主要造成了细胞代谢、蛋白质处理、细胞间相互作用、以及病毒生理相关的部分分子及其对应功能的改变。

层次聚类,重复试验,生理功能,三次

17图 3 44℃温热下 HaCaT 细胞上调差异蛋白的聚类分析与生理功能A 为上调蛋白质的层次聚类结果，Group1、2、3 分别表示三次独立重复试验中实验组/对照组的蛋白质差异表达量。B 为上调蛋白质 K 均值聚类的结果，坐标轴代标不同蛋白质表达量数值距离差异，不同颜色代表不同的聚类群。C 为上调蛋白按照 K 均值聚类分组后 GO-BP 聚类分析结果，不同颜色代表对应的聚类群，Gene Count 代表参与到不同条目的基因个数，Enrichment Score 代表不同条目的富集程度。相似地，对下调差异蛋白进行聚类分析，由 gap statistic 法与 WSS 法联立计算可推测最佳聚类数目为 5。依次对分层聚类进行对应剪枝（图 4A），对 K 均值聚类取 K 值为 5（图 4B）所得聚类结果近似。选取鲁棒性更好的 K 均值聚类结果进行GO-BP 富集分析，可以发现下调蛋白的 5 个亚群分别参与到了核糖体生物合成、RNA 代谢与病毒核酸调控、核酸转运和稳定性调控、物质代谢、细胞周期调控等生物学过程之中（图 4C）。

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