NF-κB特异性抑制剂PDTC对鼠黑素瘤B16细胞作用的实验研究

发布时间：2020-09-28 14:29

　　 黑素瘤是常见恶性肿瘤之一,但往往发现较晚且病情发展迅速。化疗是一种重要的肿瘤治疗方法,通常作为手术后的辅助治疗、肿瘤术后复发治疗和不能手术切除治疗的重要手段之一。化疗药物杀伤肿瘤细胞主要是通过促进其发生凋亡而起到治疗肿瘤的目的。然而,在化疗过程中肿瘤细胞对化疗药物诱导的凋亡具有抵抗能力,某些肿瘤甚至可在化疗后出现耐药现象,严重影响了化疗效果。显然化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡的同时激活了肿瘤细胞内的一系列生物信号,在内、外生物信号和药物诱导凋亡之间存在着平衡,促进和抑制凋亡因素之间的相互作用决定了细胞的存亡 核转录因子-KB(nuclear factor-KB, NF-κB)是一类广泛分布于真核细胞中、作用多样的转录因子,在肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭、转移和血管生成中起着关键作用。近年来有报道认为肿瘤对化疗药物的耐药与NF-KB关系密切。NF-KB能被多种因素所激活,其中包括促炎细胞因子、细胞应激以及生长因子等；它也能被化疗药物激活,包括柔红霉素、阿霉素以及顺铂等化疗药物。NF-κB也是凋亡的关键调节因子,它可以诱导某些抗凋亡因子的表达,如Survivin和Bcl-2,抑制细胞凋亡。NF-KB的激活受到NF-KB抑制剂(inhibitor of NF-κB, IκB)的严格调控,所以,在传统化疗药物治疗的同时给予NF-KB抑制剂,可能通过阻断NF-κB通路和抑制相关蛋白的表达,降低肿瘤局部复发和提高患者的生存率。 吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC)是一种小分子毓基化合物,它具有多种生化活性,如改变氧化还原状态、重金属的螯合及抑制酶的作用。PDTC最初被作为一种抗氧化剂应用,它既能抵抗自由基的毒性作用,也能干扰促炎细胞因子的生成,现已被用作NF-KB的强效抑制剂。目前已发现PDTC可以促进多种体外培养肿瘤细胞的凋亡,抑制其增殖,并可增加肿瘤细胞对化疗及放疗的敏感性。关于PDTC对黑素瘤细胞的作用,国内外尚无研究。因此,本课题通过体外实验,研究PDTC对黑素瘤B16细胞增殖和凋亡相关蛋白的影响,并研究PDTC对肿瘤血管生成和转移关系密切的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的作用。 目的：研究NF-KB特异性抑制剂PDTC对鼠黑素瘤B16细胞增殖及凋亡的影响；并测定其对VEGF表达的影响,了解PDTC体外抗黑色素瘤作用及其机制,为PDTC治疗黑色素瘤提供重要的实验室基础和理论依据。 方法：以不同浓度的PDTC (25、50、100μmol/L)作用于鼠黑素瘤B16细胞不同时间(12、24、36h)后： (1)倒置显微镜下观察细胞形态学变化； (2)四甲基噻唑氮蓝(MTT)法测定其对B16细胞增殖的抑制率； (3)比色法检测Caspase-3活性变化； (4)免疫细胞化学方法检测细胞内增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、 Bcl-2和Survivin的表达； (5) ELISA检测PDTC作用下B16细胞VEGF的表达情况。 结果：(1)倒置显微镜下,对照组细胞紧贴瓶底,细胞生长活跃,呈梭状,有较长伪足；加入PDTC后培养的B16细胞形态逐渐变圆,而典型的呈梭状生长细胞减少,与邻近细胞接触减少,并有大量细胞呈漂浮状态； (2)MTT法显示,不同浓度PDTC (25、50、100μmol/L)作用B16细胞不同时间(12、24、36h)后,能够显著抑制B16细胞的增殖,且呈现剂量和时间依赖性,实验组和对照组之间比较差异有显著性(P0.01)； (3)比色法检测显示,随着药物浓度加大,Caspase-3活性增加,与对照组比较差异有显著性(P0.01),且高浓度组比低浓度组活性增高,其差异也有显著性(P0.01)； (4)免疫组化法显示,PDTC作用24h后细胞中PCNA、 Bcl-2、 Survivin表达均下调,与对照组比较差异有显著性(P0.01)； (5) ELISA法显示,PDTC作用24h后B16细胞VEGF表达降低,与对照组比较差异有显著性(P0.01),且呈明显的剂量依赖关系。 结论：(1)PDTC能抑制鼠黑素瘤B16细胞增殖,促进细胞凋亡,存在时间和剂量依赖性； (2) PDTC能诱导鼠黑素瘤B16细胞凋亡,其治疗肿瘤机制可能是通过抑制NF-κB活性并下调PCNA、 Bcl-2和Survivin表达,促进Caspase-3活化而抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡； (3) PDTC能有效降低鼠黑素瘤B16细胞VEGF的分泌； (4) PDTC有望为黑色素瘤化学预防和化学辅助治疗带来新的前景。
【学位单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2012
【中图分类】：R739.5
【文章目录】：
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中文摘要
Abstract
1 前言
2 材料与方法
    2.1 实验材料
    2.2 实验方法
    2.3 统计学分析
3 结果
    3.1 倒置显微镜观察B16细胞生长情况
    3.2 MTT法检测不同浓度PDTC对B16细胞增殖的影响
    3.3 PDTC对黑素瘤B16细胞Caspase-3活性的影响
    3.4 PDTC对黑素瘤B16细胞PCNA蛋白表达的影响
    3.5 PDTC对黑素瘤B16细胞Bcl-2蛋白表达的影响
    3.6 PDTC对黑素瘤B16细胞Survivin蛋白表达的影响
    3.7 PDTC对黑素瘤B16细胞培养上清中VEGF蛋白表达的影响
4 讨论
    4.1 PDTC对黑素瘤B16细胞生长、增殖的抑制作用
    4.2 PDTC诱导黑素瘤B16细胞调亡
    4.3 PDTC抑制黑素瘤B16细胞VEGFe蠓置

本文编号：2828904