二甲双胍通过ERK信号通路上调B16F10黑素瘤细胞表面MHCⅠ类分子的表达

发布时间：2020-09-29 16:28

　　目的:在肿瘤中,MHCⅠ类分子提呈肿瘤相关抗原TAA给CD8~+T细胞,在其免疫监视中发挥重要作用。肿瘤细胞表面MHCⅠ类分子表达的下调甚至缺失是肿瘤细胞发生免疫逃逸的最重要的原因之一。因此,研究提高肿瘤细胞表面MHCⅠ类分子表达的手段及其调节机制,对于肿瘤的治疗具有重要意义。黑素瘤是一种恶性的皮肤肿瘤,因其高度恶性,多发转移以及预后较差而为人所熟知。二甲双胍(metformin,以下简称Met)作为新发现的抗癌药物,能够抑制黑素瘤细胞的繁殖、运动与侵袭。但其抗癌机制尚不明确,仍需进一步的研究。本实验将研究二甲双胍对B16F10黑素瘤细胞表面MHCⅠ类分子表达的调节作用,并通过ERK信号通路激活剂佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)的反证,来验证该调节依赖于二甲双胍对ERK信号通路的抑制。研究结果将为MHCⅠ类分子表达的调节机制提供新依据,为二甲双胍的抗癌机制提供新思路。方法:1细胞来源:本实验使用的小鼠B16F10(H-2~b)黑素瘤细胞来源于承德医学院附属医院中心实验室。2实验分组与干预:本实验分为两阶段,第一阶段使用二甲双胍干预细胞24h,根据浓度分为空白对照组,2.5 mM Met组,5 mM Met组,10mM Met组和20 mM Met组;第二阶段使用二甲双胍和/或PMA干预细胞24h,因PMA需溶于二甲基亚砜(DMSO)后方能在培养基中溶解,为排除DMSO的影响,所以此阶段分组中均含1%DMSO。根据干预药物种类和浓度分为空白对照组(1%DMSO组),10 mM Met+1%DMSO组,20 mM Met+1%DMSO组(仅蛋白质免疫印迹实验中含),0.125μM PMA组,10 mM Met+0.125μM PMA组。3采用流式细胞术测量两阶段各组中B16F10细胞表面H-2D~b和H-2K~b(B16F10(H-2~b)细胞表面最重要的两种MHCⅠ类分子)的表达量。4采用实时荧光定量反转录PCR(RT-qPCR)技术检测两阶段各组中B16F10细胞内H-2D~b和H-2K~b的基因转录水平表达。5采用蛋白质免疫印迹(western blot)技术测量B16F10细胞内ERK1/2和p-ERK1/2的蛋白表达量。6统计学分析:采用SPSS19.0软件统计分析并以?x±s表示计量资料,采用单因素方差分析,用用SNK-q检验进行组间的两两比较,检验水准a=0.05。结果:1.二甲双胍能够抑制B16F10细胞内p-ERK1/2的蛋白质表达,对ERK1/2的蛋白质表达无影响Western blot结果显示,经等比浓度的二甲双胍(2.5,5,10,20 mM)处理24h后,与空白对照组相比,B16F10细胞内p-ERK1/2的蛋白质相对表达量(of control)呈先降低后升高的变化趋势。经单因素方差分析,P0.01,组间差异有统计学意义。经SNK-q检验,组间两两比较,差异均具有统计学意义(P0.05)。可见,二甲双胍可以抑制B16F10细胞内p-ERK1/2的蛋白质表达,且最适浓度出现在10 mM左右。经过24h的相同处理,与空白对照组相比,各实验组B16F10细胞内ERK1/2的蛋白质相对表达量(of control)无明显变化,P0.05,组间差异无统计学意义。可见,二甲双胍对B16F10细胞内ERK1/2的蛋白质表达无影响。2.PMA提高B16F10细胞内p-ERK1/2的蛋白质表达,对ERK1/2的蛋白质表达无影响Western blot结果显示,经0.125μM PMA处理24h后,与空白对照组(1%DMSO组)相比,B16F10细胞内p-ERK1/2的蛋白质相对表达量(of control)明显升高。经SNK-q检验,P0.05,两组间差异有统计学意义。可见,PMA提高B16F10细胞内p-ERK1/2的蛋白质表达。经相同处理24h后,与空白对照组(1%DMSO组)相比,实验组B16F10细胞内ERK1/2的蛋白质相对表达量(of control)无明显变化,两组间差异无统计学意义(P0.05)。可见,PMA对B16F10细胞内ERK1/2的蛋白质表达无影响。3.二甲双胍抑制经PMA上调的B16F10细胞内p-ERK1/2的蛋白质表达,对ERK1/2的蛋白质表达无影响Western blot结果显示,经10 mM Met+1%DMSO和20 mM Met+1%DMSO处理24h后,与空白对照组(1%DMSO组)相比,B16F10细胞内p-ERK1/2的蛋白质相对表达量(of control)明显降低,P0.05,组间差异有统计学意义。但两实验组间差异并无统计学意义(P0.05)。可见,当1%DMSO存在时,二甲双胍仍可抑制B16F10细胞内p-ERK1/2的蛋白质表达,但不同浓度间的抑制作用差异可能有所变化。此时,B16F10细胞内ERK1/2的蛋白质相对表达量(of control)无明显变化,两实验组与对照组间差异无统计学意义(P0.05)。可见,当1%DMSO存在时,二甲双胍对B16F10细胞内ERK1/2的蛋白质表达无影响。经10 mM Met+0.125μM PMA处理24h后,与0.125μM PMA组相比,B16F10细胞内p-ERK1/2的蛋白质相对表达量(of control)明显降低,P0.05,组间差异有统计学意义。可见,二甲双胍能够抑制经PMA上调的B16F10细胞内p-ERK1/2的蛋白质表达。此时,B16F10细胞内ERK1/2的蛋白质相对表达量(of control)无明显变化,两组间差异无统计学意义(P0.05)。可见,二甲双胍对PMA处理后的B16F10细胞内ERK1/2的蛋白质表达并无影响。4.二甲双胍上调B16F10细胞表面H-2D~b和H-2K~b的表达流式细胞术结果显示,经等比浓度的二甲双胍(2.5,5,10,20 mM)处理24h后,与空白对照组相比,H-2D~b和H-2K~b阳性的细胞比例均呈峰样变化。经单因素方差分析,P0.01,组间差异有统计学意义。经SNK-q检验,组间两两比较,除空白对照组与2.5 mM Met组的细胞表面H-2K~b的表达差异无统计学意义外(P0.05),其它组间两两比较,差异均具有统计学意义(P0.05)。可见,二甲双胍能够上调B16F10细胞表面H-2D~b和H-2K~b的表达,且最适浓度出现在10 mM左右。5.PMA降低B16F10细胞表面H-2D~b和H-2K~b的表达流式细胞术结果显示,经0.125μM PMA处理24h后,与空白对照组(1%DMSO组)相比,H-2D~b和H-2K~b阳性的细胞比例均降低。经SNK-q检验,P0.05,组间差异有统计学意义。可见,PMA降低B16F10细胞表面H-2D~b和H-2K~b的表达。6.二甲双胍上调经PMA抑制的B16F10细胞表面H-2D~b和H-2K~b的表达流式细胞术结果显示,经10 mM Met+1%DMSO处理24h后,与空白对照组(1%DMSO组)相比,B16F10细胞表面H-2D~b和H-2K~b的表达均明显升高,P0.05,组间差异有统计学意义。可见,当1%DMSO存在时,二甲双胍仍可提高B16F10细胞表面H-2D~b和H-2K~b的表达。经10 mM Met+0.125μM PMA处理24h后,与0.125μM PMA组相比,H-2D~b和H-2K~b阳性的细胞比例均升高,P0.05,组间差异有统计学意义。可见,二甲双胍能够上调经PMA抑制的B16F10细胞表面H-2D~b和H-2K~b的表达。7.二甲双胍上调B16F10细胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表达RT-qPCR结果显示,经二甲双胍(5,10,20 mM)处理24h后,与空白对照组相比,B16F10细胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表达均升高,P0.05,组间差异有统计学意义。空白对照组与2.5 mM Met组之间,10 mM Met与20 mM Met组之间,B16F10细胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表达差异均无统计学意义(P0.05)。可见,二甲双胍能够上调B16F10细胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表达。8.PMA降低B16F10细胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表达RT-qPCR结果显示,经0.125μM PMA处理24h后,与空白对照组(1%DMSO组)相比,B16F10细胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表达均降低,P0.05,组间差异有统计学意义。可见,PMA能够降低B16F10细胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表达9.二甲双胍上调经PMA抑制的B16F10细胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表达RT-qPCR结果显示,经10 mM Met+1%DMSO处理24h后,与空白对照组(1%DMSO组)相比,B16F10细胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表达均明显升高,P0.05,组间差异有统计学意义。可见,当1%DMSO存在时,二甲双胍仍可提高B16F10细胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表达。经10 mM Met+0.125μM PMA处理24h后,与0.125μM PMA组相比,B16F10细胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表达均升高,P0.05,组间差异均有统计学意义。可见,二甲双胍能够上调经PMA抑制的B16F10细胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表达。结论:1.ERK信号通路能够调节B16F10细胞MHCⅠ类分子的表达。2.二甲双胍通过抑制ERK信号通路上调B16F10黑素瘤细胞表面MHCⅠ类分子的表达。
【学位单位】：承德医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R739.5
【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
英文缩写
前言
材料与方法
结果
附图
讨论
结论
参考文献
综述
参考文献
致谢
个人简历

【参考文献】