PDGFRα在人黑素细胞氧化应激损伤中的作用和机制研究

发布时间：2020-10-16 11:52

　　 背景:白癜风是以局限性脱色斑、功能性黑素细胞减少或消失为特征的获得性皮肤病,是一种多发性、难治性疾病,发病率逐年上升。白癜风的发病机制尚未被清楚地阐明,现有的研究结果涉及多个学说。近年来越来越多的研究认为,白癜风是遗传因素和环境因素共同作用,造成黑素细胞受到损伤的结果。在特定的个体遗传背景下,氧化应激可能是白癜风皮损最早期的事件,它启动黑素细胞的破坏或凋亡,诱导针对自身抗原的特异性免疫应答。很多研究表明,白癜风患者的表皮有H2O2的蓄积,从而引起黑素细胞的氧化损伤。可通过H2O2建立诱导黑素细胞的氧化应激损伤体外模型,对白癜风复杂的发病机制进一步研究。遗传学研究显示,个体罹患疾病的易感性由基因遗传变异决定。一些位于基因编码区的SNP或突变可影响基因的表达和功能,与白癜风的发病相关。在分子流行病学研究检测出的易感候选基因中,中国家族性白癜风患者携带血小板源性生长因子受体α(PDGFRα)编码基因位点突变率显著高于正常人群,支持该基因在部分白癜风患者发病中可能具有作用。同时研究显示氧化应激可诱导PDGFRα酪氨酸磷酸化,PDGFRα促进氧化应激损伤中一些种类的细胞的生存。那么在H2O2诱导黑素细胞氧化应激损伤中,PDGFRα及其下游信号通路是否在黑素细胞生存中发挥作用,成为本课题研究的主要内容。目的:本课题通过调节PDGFRα基因PDGFRA的表达,研究该基因对人黑素细胞的自噬、凋亡现象及一些重要功能蛋白的影响和作用机制,以阐述PDGFRα在H2O2诱导的氧化应激损伤中与黑素细胞生存相关的生物学功能。方法:1.采用RT-PCR和Western-blot的方法,分别检测人原代黑素细胞、正常人表皮永生化黑素细胞系PIG1、白癜风患者表皮永生化黑素细胞系PIG3V中PDGFRA的m RNA和蛋白的表达情况。2.分别在正常人黑素细胞系PIG1、白癜风患者黑素细胞系PIG3V中,采用CCK-8的方法检测细胞活性并确定最适H2O2处理终浓度。分别在不同时间和使用不同浓度H2O2处理黑素细胞PIG1,采用Western-blot的方法检测PDGFRα的表达变化。3.分别转染黑素细胞PIG1、黑素细胞PIG3V PDGFRA-si RNA、人PDGFRA过表达质粒,采用q RT-PCR、Western-blot的方法,检测两种黑素细胞系中PDGFRA的m RNA和蛋白的表达情况。4.分别下调和上调黑素细胞PIG1、黑素细胞PIG3V的PDGFRA并经H2O2处理24h后,采用流式细胞术的方法检测两种黑素细胞的凋亡情况。5.分别下调和上调黑素细胞PIG1、黑素细胞PIG3V的PDGFRA并经H2O2处理24h后,采用Western-blot的方法检测两种黑素细胞的自噬相关蛋白、抗凋亡相关蛋白及黑素小体相关蛋白的表达情况。6.确定PDGFRα特异性配体PDGF-AA的最适处理浓度后,使用PDGF-AA或/和H2O2处理黑素细胞PIG1 24h,采用Western-blot的方法检测黑素细胞PIG1中PDGFRα、主要自噬蛋白、黑素细胞功能核心调节分子,以及PI3K/AKT/m TOR通路分子的表达情况。7.转染表达人LC3的荧光蛋白质粒后,分别用PDGF-AA和H2O2处理两种黑素细胞24h,在荧光显微镜下观察黑素细胞胞质中自噬体的形成情况。之后采用CCK-8的方法检测黑素细胞PIG1活性以确定该通路抑制剂最适处理浓度并处理,采用Western-blot的方法检测PDGFRα及下游相关通路分子的表达情况。结果:1.在体外培养的人原代黑素细胞、正常人黑素细胞系PIG1、白癜风患者黑素细胞系PIG3V中均检测出PDGFRα基因m RNA和蛋白的表达。2.在两种黑素细胞中建立的氧化应激损伤模型中,确定了正常人黑素细胞系PIG1和白癜风患者黑素细胞系的H2O2处理最适终浓度。在黑素细胞PIG1中分别给予不同浓度的H2O2处理,检测到PDGFRα的表达与H2O2呈正相关。在不同时间点给予H2O2处理黑素细胞PIG1,检测到PDGFRα的表达在30 min内明显增加。3.在黑素细胞PIG1、黑素细胞PIG3V中,筛选出干涉PDGFRα基因m RNA和蛋白表达的最适si RNA。将PDGFRα基因过表达质粒分别转染这两种黑素细胞,检测到该基因m RNA和蛋白表达显著增加。4.在黑素细胞PIG1、黑素细胞PIG3V中分别上调和下调PDGFRα基因并诱导氧化应激,流式细胞术结果显示:两种黑素细胞中,与对照组相比,转染PDGFRA-si RNA的黑素细胞凋亡率明显增加(P0.01),转染PDGFRα基因过表达质粒的黑素细胞凋亡率明显减少(P0.05)。Western-blot检测结果显示:两种黑素细胞中,与对照组相比,转染PDGFRA-si RNA后LC3II/I、Beclin-1表达明显增加,Bcl-2表达明显减少,转染PDGFRα基因过表达质粒后LC3II/I、Beclin-1表达明显减少,Bcl-2表达明显增加。5.Western-blot检测结果显示:正常人黑素细胞PIG1中,与对照组相比,PDGFRA-si RNA的下调组MITF、gp100、TYR、TRP-1表达明显减少,PDGFRα基因过表达质粒的上调组MITF、gp100、TYR、TRP-1表达明显增加;白癜风患者黑素细胞PIG3V中,与对照组相比,PDGFRA-si RNA的下调组MITF、gp100、TYR、TRP-1表达明显减少,PDGFRα基因过表达质粒的上调组MITF、gp100表达明显增加,TYR、TRP-1表达未见明显变化。6.不同浓度PDGF-AA处理黑素细胞PIG1后,检测到p-PDGFRα,p-AKT,p-m TOR蛋白表达随PDGF-AA浓度增加而增加。PDGF-AA和H2O2共处理黑素细胞PIG1,检测到与对照组相比,p-AKT、p-m TOR、MITF表达明显增加,LC3II/I、Beclin-1表达明显减少。7.转染黑素细胞PIG1、黑素细胞PIG3V LC3过表达质粒,经PDGF-AA预处理、H2O2诱导氧化应激后,在荧光显微镜下观察到LC3红色荧光蛋白定位的自噬体数较无PDGF-AA处理组明显减少。8.确定黑素细胞PIG1信号通路分子PI3K、AKT、m TOR抑制剂的最适处理浓度,给予H2O2和/或PDGF-AA处理。同时用PI3K抑制剂LY294002、AKT抑制剂MK2206处理后,检测到p-AKT、p-m TOR表达明显减少;用m TOR抑制剂Rapamycin处理后,检测到p-m TOR表达明显减少。三种抑制剂处理后,LC3II/I、Beclin-1表达均明显增加。结论:1.体外培养的人原代黑素细胞、正常人表皮永生化黑素细胞系PIG1、白癜风患者表皮永生化黑素细胞系PIG3V都表达PDGFRα,PDGFRα随H2O2浓度增加表达明显增加。2.在人黑素细胞PIG1、PIG3V中,下调PDGFRα基因的表达,自噬相关蛋白表达明显增加,抗凋亡相关蛋白表达明显减少,黑素小体相关蛋白表达明显减少;自噬和凋亡水平都明显增高,不利于H2O2诱导的氧化应激下黑素细胞的生存。相反,上调PDGFRα基因的表达,自噬相关蛋白表达明显减少,抗凋亡相关蛋白表达明显增加,黑素小体相关蛋白表达明显增加;自噬和凋亡水平都明显降低,有利于氧化应激下黑素细胞的生存。3.在H2O2诱导的氧化应激下,PDGF-AA/PDGFRα减少了黑素细胞PIG1自噬体的形成,可通过PI3K/AKT/m TOR信号通路抑制LC3II/I和Beclin-1的表达,减少了黑素细胞的自噬性死亡。因此PDGF-AA/PDGFRα在氧化应激中可通过PI3K/AKT/m TOR信号通路对人黑素细胞的生存起到保护作用。
【学位单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R758.41
【部分图文】：

Gallini R, Betsholtz C. Role of platelet-derived growth factors in physiology and medicienes & development 2008;22(10):1276-1312.图1 PDGFRα及下游主要信号通路示意图4 PDGF/PDGFR 相关疾病的治疗在PDGF信号发挥作用的肿瘤性疾病中，治疗上使用一些抑制剂相对安全，抑DGFR的不同策略包括阻断性抗体、针对配体和激酶的抑制剂[92]。临床试验提示马替尼等药物，阻断PDGFR激酶活性，可有效治疗多种PDGFR活化的人类癌症[9的信号分子抑制剂也正在应用中，如小分子靶向PI3K，AKT，mTOR等联合治以提高疗效，还有一些研究阐述PDGF在肿瘤基质、血管生成、人纤维性疾病、等中的作用[93]。

1 pCMV6-Entry-PDGFRΑ 过表达质粒的和培养的分离和培养碘伏，浸泡包皮环切术后的新鲜成人包皮DMEM/F12培养基的细胞培养皿中，用无组织、血管等，之后用PBS清洗2遍，将表皮滤器将Dispase分散酶溶液加入有皮片的清洗2遍后，轻轻将真皮与表皮剥离，表温消化约20 min后，用含10%胎牛血清的

0.4 mM，0.5 mM，0.6 mM，0.7 mM终浓度的H2O2共孵育，培养于基，作用时间为24 h，之后用CCK-8的方法检测黑素细胞的活性变化。黑素细胞PIG1活性随H2O2浓度增加而降低，当H2O2处理终浓度为0.4 胞PIG1的活性开始出现明显降低，降至（77.94±5.21）%， P<0.05，义；当H2O2处理终浓度为0.5 mM时，细胞活性显著降低，降至（66.31±，具有统计学意义。如图1-5所示，黑素细胞PIG3V活性也随H2O2浓度当H2O2处理终浓度为0.3 mM时，黑素细胞PIG3V的活性开始出现显著59.28±6.02）%，P<0.01，具有统计学意义。选择0.5 mM终浓度的H胞PIG1和0.3 mM终浓度的H2O2处理黑素细胞PIG3V，既可诱导黑素细效应使活性受明显抑制，又不会导致细胞死亡过多，因此作为后续实素细胞诱导氧化应激的处理浓度。同时结果也提示，白癜风患者黑与正常人黑素细胞PIGI的反应性相比，黑素细胞PIG3V对H2O2诱导的氧。

本文编号：2843220