PAG1棕榈酰化位点突变与皮肤鳞状细胞癌的相关性研究

发布时间：2020-10-24 15:03

　　 目的:本研究旨在探讨富含鞘磷脂的脂膜微区结合酪氨酸磷酸化蛋白(phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains,PAG),人源性称为PAG1。棕榈酰化位点突变(即C-X-X-C突变为A-X-X-A)对皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma,cSCC)A431细胞系生物学行为的影响,并进一步研究棕榈酰化位点突变的PAG1与Src信号传递中相关调控分子的相关性及其分子机制。方法:通过Uniprot蛋白数据库查询PAG1分子结构,选择将PAG1棕榈酰化位点中的半胱氨酸突变为丙氨酸,选用A431细胞系为研究对象,用携带增强绿色荧光(enhanced green fluorescent protein,EGFP)信号的过表达野生型PAG1和棕榈酰化位点突变的PAG1以及仅含有增强绿色荧光的慢病毒载体转染A431细胞,建立了稳定过表达野生型PAG1的A431细胞株(WT-PAG1组)、过表达PAG1棕榈酰化位点突变的A431细胞株(mutant-PAG1组)以及只带有绿色荧光的阴性对照组(control组)和未经处理的空白对照组(parental组)。用激光共聚焦显微镜检测经慢病毒转染后WT-PAG1组、mutant-PAG1组以及control组细胞中绿色荧光的表达情况;用流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测扩大培养后细胞转染率,用分选FCM分选3组细胞中携带绿色荧光的细胞,并采用有限稀释法筛选获得单克隆目的细胞系并扩大培养。实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RT-PCR)法检测细胞内Pag1 mRNA的表达水平;蛋白印迹法(Western blot)检测细胞内PAG1蛋白的表达水平;用细胞增殖实验CCK8法检测A431细胞的增殖能力;Annexin V-APC/PI双染法检测棕榈酰化位点突变对A431细胞凋亡的影响;划痕实验和Transwell迁移检测A431细胞的迁移能力;Transwell侵袭实验检测A431细胞的侵袭能力。Western Blot检测与PAG1结合的抑制性酪氨酸激酶Csk以及Src活化信号通路中重要的信号分子Fyn的表达水平。结果:(1)在经慢病毒转染96h后,用激光共聚焦显微镜观察WT-APG1、mutant-PAG1以及control组绿色荧光几乎遍布整个视野;FCM检测经慢病毒转染后,3组细胞携带荧光的阳性率,结果显示control组,WT-PAG1组以及mutant-PAG1组的荧光阳性率分别为86.2%、88.1%及87.8%,随后用RT-PCR检测细胞中Pag1基因mRNA的表达水平,结果显示,WT-PAG1组和mutant-PAG1组中Pag1基因mRNA的表达量分别为parental组的1.65和1.68倍,差异具有统计学意义(P0.01)。进一步用Western Blot检测细胞中PAG1蛋白的表达水平,结果显示,与control组相比,WT-PAG1组和mutant-PAG1组转染后PAG1蛋白的表达量分别为control组的2.17和2.24倍,与parental组相比差异具有统计学意义(P0.001),证明转染成功。(2)细胞增殖实验结果显示:与parental组和control组A431细胞相比,WT-PAG1组细胞增殖明显减弱,在2-6天组间的差异具有统计学意义(P0.01),而mutant-PAG1组与parental组和control组A431细胞相比差异没有统计学差异(P0.05),说明PAG1能明显抑制A431细胞系的增殖,而棕榈酰化位点突变的PAG1丧失了抑制细胞增殖的能力。(3)细胞凋亡结果显示,parental组和control组的凋亡率分别为5.30%±0.04%和4.20%±0.06%,WT-PAG1的A431细胞凋亡明显增加,凋亡率为11.20%±0.04%,与parental和control组相比差异具有统计学意义(P0.001);而mutant-PAG1组A431细胞的凋亡率为3.50%±0.04%,与parental和control组相比没有统计学差异(P0.05)。(4)划痕修复实验结果显示,与parental组和control组相比,WT-PAG1组细胞愈合能力明显降低(P0.001,P0.01)。而mutant-PAG1组与parental组和control组相比没有统计学差异(P0.05);Tranwell迁移实验结果表明,WT-PAG1组细胞的迁移能力与parental和control组相比明显降低。与WT-PAG1组相比,mutant-PAG1组细胞迁移能力明显增高(P0.001)。(5)侵袭实验结果显示,WT-PAG1组细胞侵袭能力,与parental组和control组相比明显降低。而与WT-PAG1组相比,mutant-PAG1组侵袭能力明显增高(P0.001)。(6)Western blot结果表明,与parental组和control组相比,WT-PAG1组细胞Csk和Fyn的表达水平明显增加(P0.001),而mutant-PAG1组与parental组和control组相比,Csk和Fyn的表达水平差异无统计学意义(P0.05)。结论:(1)成功构建了稳定过表达PAG1棕榈酰化位点突变的A431细胞株。(2)棕榈酰化位点突变的PAG1会减弱甚至丧失抑制皮肤鳞状细胞癌A431细胞系增殖、诱导细胞凋亡及运动、迁徙等生物学行为的能力。(3)在cSCC中,PAG1棕榈酰化位点突变后,通过Src家族激酶调控细胞活性的生物学功能将减弱甚至丧失。
【学位单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R739.5
【部分图文】：

图 1 PAG1 蛋白质的一级序列Fig.1 The primary protein sequence of PAG1选在棕榈酰化位点中的半胱氨酸突变成丙氨酸，如图 2 所示，因为这样一方面除了原先的半胱氨酸侧链上的活性基团，另一方面换成了体积较小，在侧链上只

图 2 PAG1 分子棕榈酰化位点突变示意图Fig.2 Schematic diagram of utation of PAG1 molecule palmitylation site为了成功将 4 种目的基因在 A431 细胞系中进行表达，提高其表达效率，本采用将目的基因包装构建成慢病毒载体的方法，进而通过病毒感染 A431 细胞

共聚焦显微镜观察经慢病毒转染的 3 组 A431 细胞株后绿色荧光蛋白的表The fluorescence detection results of EGFP after transfection Lentivirus by laser scanning microscope (×40)测转染效率测慢病毒感染 A431 细胞的转染效率（图 4），control 组，WT
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本文编号：2854613