背景麻风病是由麻风分枝杆菌引起的慢性传染性疾病。麻风分枝杆菌主要侵犯皮肤和神经,造成肢体的畸形和残废。目前,麻风诊断常见的方法包括皮肤组织液细菌学检查,组织病理,血清抗体检测等,但是仍有一些临床表现不典型、少菌型、纯神经炎型麻风病患者会出现漏诊和误诊。而延误诊断可能会造成不可逆性神经损伤,面容毁损等。因此,麻风病的早期精准诊断非常重要。经典麻风感染分为五大类,呈光谱样分布,对不同型别麻风患者差异表达的相关分子,代谢产物,蛋白等研究有利于发掘更有价值的诊断标志物,同时也有利于对其发病机制的探索研究。目的:挖掘不同型别麻风病患者血清外泌体特异性分子改变,同时探索相关机制。方法:1.对不同型别麻风病患者和正常对照血清外泌体进行miRNA微阵列检测分析,获得差异显著的miRNA,扩大样本进行验证,确定差异表达显著的miRNA,单独评估或使用logistic二元回归模型综合变量,绘制ROC曲线评估其诊断价值。2.在体外细胞水平建立人单核/巨噬细胞和麻风菌共培养体系,验证差异表达显著的miRNA在培养上清外泌体和细胞层面的表达水平。3.通过体外细胞实验验证差异表达miRNA对预测靶基因的调控。4.利用非靶向代谢组学的方法对麻风病患者和正常对照血清外泌体进行分析,寻找有差异表达的代谢分子,绘制ROC曲线评估其诊断效力。5.利用蛋白质谱方法对麻风病患者和正常对照血清外泌体进行检测分析,寻找有差异表达的代谢分子,进行生物信息学分析,病绘制ROC曲线评估其诊断效力。结果:1.通过miRNA芯片(T-lep患者10例、L-lep患者10例、2型麻风反应患者10例、正常对照人员10例)检测并扩大样本验证发现miR4485-3p(p0.01)和miR1227-5p(p0.05)在麻风病患者中表达水平高于正常对照,且其均在L-lep中表达高于T-lep,前者差异有统计学意义。ROC曲线下面积显示miR1227-5p为 0.648(p=0.048),miR4485-3p 为 0.747(p=0.001),通过 logistic 二元回归模型以两者预测概率值绘制的ROC曲线下面积为0.788(p0.001)。对其进行靶基因生物信息学预测,miR4485-3p在L-lep中对RAP2B,HPSE,SLC11A,TLR4基因有显著调控作用,在T-lep中是CD40LG;miR1227-5p在L-lep中对APOC1,CD5L,SLC11A1 有显著调控,在 T-lep 中是 CYP27B1,S100B。GO和KEGG分析发现miR4485-3p的通路富集为巨噬细胞激活涉及的免疫应答通路和T细胞受体信号通路,miR1227-5p是骨骼肌肉组织发育阳性通路,细胞色素P450酶对外源生物代谢作用通路,花生四烯酸代谢通路。2.在巨噬细胞(人单核/巨噬细胞和THP1细胞)构建体外麻风菌感染模型中发现细胞上清外泌体和细胞中miR4485-3p在两者中均有显著上调表达,且有时间和菌浓度依赖性,以内参miR16-5p作为对照并未发现明显变化。3.在麻风菌单核/巨噬细胞感染体系中转染miR4485-3p模拟物并共培育自体T细胞以及添加IL10发现,miR4485-3p通过靶向抑制CD4+T细胞表面CD40L受体,从而进一步下调巨噬细胞表面CD40表达从而抑制巨噬细胞的活性,其表面活化性受体CD86出现下调,相关细胞因子TNFa,IL1B,IL6表达下降,增加了巨噬细胞凋亡,保持细菌的活力,而抑制物转染可观察到相反作用。4.对麻风患者(T-lep型患者6例,L-lep患者7例,T1LR型患者6例,T2LR型患者3例,正常对照6例)血清外泌体非靶向代谢组学研究共鉴定了 2109个化合物,根据(FC2,P0.01)筛选出各组别中均上调的代谢物是CerP(d18:1/24:1(15Z)),PC(24:1(15Z)/14:1(9Z)),PS(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z)/16:0),TG(24:1(15Z)/15:0/22:4(7Z,10Z,13Z,16Z)),PS(MonoMe(13,5)/MonoMe(13,5)),而下调的化合物是2-linoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine。而根据样本中含量(强度)绘制ROC曲线显示前三个高表达的代谢物曲线下面积分别是0.917(p=0.002),0.992(p=0.000),0.939(p=0.001)而唯一的下调表达化合物曲线下面积为0.242(p=0.57)。而对脂质进行同类别归纳分析发现PC,PS,PI,TG,DG类脂质在疾病组均高表达,且PE,PS,TG,DG在T1LR中表达显著升高,PC,PE,CE在T-lep和L-lep中有显著差异。5.通过对麻风病患者(T-lep 6例,L-lep 7例,T1LR患者5例,T2LR患者4例,正常对照7例)血清外泌体蛋白组学研究共检测到的1767个蛋白分子,根据FC2(或1/2)和p0.05作为筛选标准,发现T-lep与正常对照比有86个上调表达的蛋白,65个下调表达的蛋白;而L-lep中上调83个蛋白,下调59个蛋白;T1LR中上调68个蛋白,下调118个蛋白;T2LR中上调63个蛋白,下调102个蛋白。而其中D9YZU5(HBB)在所有疾病组中均有升高,以不同样本蛋白含量绘制ROC曲线显示包含反应组曲线下面积0.740(p=0.059),不包含反应组别为0.78(p=0.043),而CD5L分子在疾病组中明显下降,在T-lep和反应组(尤其T1LR)中下降显著。结论:1.血清外泌体miR4485-3p有成为麻风病诊断生物标志物潜力。2.麻风感染巨噬细胞后,可通过外泌体靶向运送miR4485-3p调控CD4+T细胞表面CD40L受体,同时在IL10协同作用下反馈性抑制其功能。3.非靶向代谢化合物 CerP(d18:1/24:1(15Z)),PC(24:1(15Z)/14:1(9Z)),PS(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z)/16:0)有成为麻风病诊断生物标志物的可能。4.T-lep和L-lep中上调蛋白明显多于上调蛋白,而T1LR和T2LR中下调蛋白更多,HBB可在麻风患者中升高,推测其有成为诊断标志物可能,CD5L在麻风病患者中表达下降,在T-lep和反应组别中显著,可能成为少菌型诊断标志物,亦可能成为麻风反应预测性分子。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R755
【部分图文】：
封装在外泌体中，细胞内体聚集形成多囊泡体，然后再通过外泌方式将同时承载??巨噬细胞和结核杆菌分子的胞外小体排出细胞，通过释放外泌体的内容物，介导??细胞间的通讯，改变受体细胞（巨噬细胞／树突状细胞）的信号通路（图２）?［３１］。??从感染细胞释放分枝杆菌外泌体，可以通过流式细胞仪检测发现该外泌体的膜表??面具有ＭＨＣ－ＩＩ、热休克蛋白７０?（Ｈｓｐ７０）、溶酶体相关膜蛋白１?（ＬＡＭＰ１）和分??枝杆菌抗原相关的模式分子（ＰＡＭＰｓ），这些分子在分枝杆菌抗原递呈中具有??极其重要的作用；进一步地研究也证实这些胞外小体可在体外特异地激活ＣＤ４＋??ＢＴ１??
图３血清外泌体提取结果??（２）血清外泌体透射电镜检测可见提取的血清外泌体溶富含直径３０－１００ｎｍ??
图４外泌体透射电镜分析??溶液经粒径仪观察到囊泡的平均最大亮度较均匀，杂质较少（右下为视频？？？？？？？息?Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?＆?Ｂｒｏｗｎｉａｎ＊＊？?＾?＿?．?＿?？?＊?????Ｖｉｄｅｏ?Ａｎａｌｙｓｉｓ??ＰＡ?Ｒ丁?Ｉ?［?Ｌ?￡?＝?Ｅｌ丁?Ｒ?１?Ｘ?Ｌａｓｅｒ?Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ?ＭｉｃｒｏｓＯｐｅｒａｔｏｒ?（Ｒｅｐｏｒｔ）：?ＺｅｉａＶｉｅｗ??Ｖｔａｅｒｏ?Ｏｐｅｒａｔｏｒ：?ＺｅｔａＶｉｅｗ??
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本文编号：
2879087
