背景:原发性皮肤淀粉样变(Primary cutaneous amyloidosis,PCA)是一种顽固性瘙痒性皮肤病,其典型的组织病理学改变为表皮棘细胞层增厚和角化过度,真皮乳头层可见大量淀粉样物质沉积。淀粉样物质的形成与角质形成细胞凋亡密切相关。大多数原发性皮肤淀粉样变病例为散发,但是南美洲和台湾曾多次报道过家族聚集现象,即家族性原发性皮肤淀粉样变(Familiar primary cutaneous amyloidosis,PCA)。家族性原发性皮肤淀粉样变的致病基因被定位于OSMR基因。OSMR基因编码OSMRβ蛋白,后者为OSM二型受体及IL31受体的组成成分,这两种受体分别与两种细胞因子OSM和IL31结合,通过JAK-STAT和MAPK通路完成磷酸化和信号传导。当OSMR基因发生突变时,一方面突变的角质形成细胞更易发生凋亡,导致角蛋白在真皮浅层沉积;另一方面,OSMRβ/IL31RA信号通路障碍,对抗凋亡的作用减弱,角质形成细胞凋亡增加,退化的角化性物质在真皮浅层沉积,最终导致皮肤淀粉样变的发生。沙利度胺对多种顽固性瘙痒性皮肤病有效,可能是通过不同的作用机制。原发性皮肤淀粉样变治疗抵抗,传统治疗方法如抗组胺药、糖皮质激素及窄波紫外线效果有限。曾有报道应用沙利度胺治疗轻链淀粉样变。我们前期应用沙利度胺成功治疗了家族性原发性皮肤淀粉样变患者,临床应用发现沙利度胺可明显缓解皮肤瘙痒,并在治疗后的组织切片中发现淀粉样物质明显减少。在前期实验中,我们将OSMR基因敲除细胞系进行全蛋白组学鉴定,得出多种差异蛋白表达,差异蛋白的功能、KEGG富集结果。其中,以TC-PTP上调表达最为显著。同时,KEGG通路富集结果显示,上调蛋白在Jak-STAT通路富集现象最为显著。T细胞蛋白酪氨酸磷酸酶(TC-PTP;由PTPN_2编码),是PTP家族中第一个被认知的成员,特异性表达于胚胎和成人组织细胞中,尤其在造血系统存在高表达。TC-PTP参与包括细胞周期调控和细胞凋亡等通过去磷酸化来完成各种生物学功能的调节,参与调节的目标底物包括JAK1、JAK3、Stat1、Stat3、Stat5等,TC-PTP对JAK/Stat通路起到负向调节的作用。学者通过构建PTPN_2基因敲除鼠,提取小鼠皮肤组织上皮细胞,应用Western Blot方法检测P-AKT和P-Stat3的水平,结果显示二者表达均升高。紫外线照射能够增加Stat3磷酸化水平,同时能够使TC-PTP表达增加。学者通过构建PTPN_2基因敲除及过表达细胞系,给予不同时间紫外线照射干预,得出结论,在紫外线照射下,TC-PTP能够抑制Stat3介导的小鼠角质形成细胞的增殖功能,因此,TC-PTP在调节细胞增殖和凋亡中具有重要的作用。OSMR基因是否能够通过上调TC-PTP的表达,对家族性原发性皮肤淀粉样变的发生机制产生影响。沙利度胺是否通过作用于Stat3通路对皮肤淀粉样变的发生产生影响,为本实验关注的重点。实验材料和方法:1、实验对象细胞系选择为人角质形成细胞系(HaCaT),购于江苏凯基生物技术股份有限公司。2、siRNA转染方法敲除目标基因OSMR,PTPN_2将细胞接种于6孔板,每孔50万个细胞。Lipofectamine?RNAiMAX被用作转染试剂。Silencer?Select negative control siRNA 1被用作阴性对照。转染后于24、48、72小时提取RNA和蛋白用于验证敲除效率。使用10 nmol siRNA为最终浓度。3、Icelligence方法筛选沙利度胺作用浓度将细胞接种于Icelligence细胞培养板,分别加入沙利度胺浓度为0,10nM,100nM,1000nM,10000nM,通过细胞增殖曲线,确定药物对细胞增殖无影响的最适浓度。4、MTS检测加入沙利度胺前后siOSMR对细胞增殖的影响利用MTS方法检测加入沙利度胺前后OSMR基因敲除对细胞增殖的作用。将siOSMR细胞组,加入沙利度胺后siOSMR细胞组和阴性对照组细胞接种于96孔板中,分别于第0天、1天、2天、3天和4天进行检测,490nm处观察吸光度值。5、流式细胞术检测加入沙利度胺前后siOSMR对细胞凋亡的影响利用流式细胞术检测加入沙利度胺前后siOSMR对细胞凋亡的影响。将siOSMR细胞组,加入沙利度胺后si OSMR细胞组和阴性对照组细胞接种于六孔板中,用FITC AnnexinⅤ凋亡试剂盒和PI试剂检测细胞凋亡的变化。6、利用慢病毒转染技术建立OSMR基因敲除稳转细胞系细胞接种于24孔板,将Hacat细胞MOI值定为100,确定慢病毒转染量。于转染后24、48、72小时于荧光显微镜观察转染效率。加入puromycin对转染细胞进行筛选。应用实时定量PCR检测,western blot检测的方法对建立的可稳定传代细胞进行验证。7、对OSMR基因敲除稳转细胞系进行人细胞样本全蛋白定量蛋白质组学鉴定将细胞分为慢病毒对照组和OSMR基因敲除组,进行人细胞样本全蛋白定量蛋白质组学鉴定,包括差异蛋白表达检测和差异蛋白功能分类、功能富集和聚类分析。8、Western blot方法检测沙利度胺对Stat1、3、5,Akt通路蛋白表达的影响采用Western blot方法检测加入沙利度胺前后Stat1、3、5,Akt通路蛋白表达水平的变化。按照蛋白提取法提取细胞中蛋白;BCA检测蛋白浓度;经制胶、跑胶、转膜、封闭、一抗、二抗、ECL显色并拍照,观察蛋白表达变化。9、统计学分析利用GraphPad Prism 5软件对资料进行统计学分析及图表的绘制,组间比较用t检验及方差分析,p0.05时认为差异有统计学意义。结果:1、OSMR基因敲除对角质形成细胞增殖功能的影响应用MTS方法,检测OSMR基因敲除对角质形成细胞增殖功能的影响。结果显示,OSMR基因敲除可以显著抑制细胞的增殖能力,差异具有统计学意义。(p0.001)2、OSMR基因敲除对角质形成细胞凋亡的影响采用流式细胞术的方法,检测OSMR基因敲除对角质形成细胞凋亡的影响。结果显示,OSMR基因敲除可以使角质形成细胞凋亡增加,重复三次实验,结果差异具有统计学意义。(p0.05)3、沙利度胺对OSMR基因敲除角质形成细胞增殖功能的影响应用MTS方法,检测沙利度胺对OSMR基因敲除角质形成细胞增殖功能的影响。结果发现,沙利度胺可以增加OSMR基因敲除角质形成细胞的增殖能力,差异具有统计学意义。(p0.05)4、沙利度胺对OSMR基因敲除角质形成细胞凋亡的影响采用流式细胞术的方法,检测沙利度胺对OSMR基因敲除角质形成细胞凋亡的影响。结果发现,沙利度胺降低OSMR基因敲除角质形成细胞的凋亡,重复三次实验,差异具有统计学意义。(p0.05)5、沙利度胺对OSMR相关通路蛋白表达的影响应用Western Blot方法,检测沙利度胺对OSMR相关通路蛋白表达的影响。结果显示,OSMR基因敲除角质形成细胞P-Stat3表达量减少,加入沙利度胺后,P-Stat3表达量增加。OSMR基因敲除对Stat3的表达无明显影响。OSMR基因敲除角质形成细胞Stat1和P-Stat1表达量均减少,以P-Stat1减少更为明显。加入沙利度胺后,Stat1和P-Stat1表达量无明显增加。OSMR基因敲除对角质形成细胞Stat5和P-Stat5表达量无明显影响。OSMR基因敲除对角质形成细胞Akt和P-Akt表达量无明显影响。6、人细胞样本全蛋白定量蛋白质组学鉴定结果将OSMR基因敲除稳转细胞系与慢病毒转染对照组进行人细胞样本全蛋白定量蛋白质组学鉴定,结果显示,OSMR基因敲除可以导致多种差异蛋白表达,其中以上调TC-PCP表达最为显著。KEGG通路富集结果显示,上调蛋白在Jak-STAT通路富集现象最为显著。7、PTPN_2基因敲除对角质形成细胞增殖功能的影响应用MTS方法,检测PTPN_2基因敲除对角质形成细胞增殖功能的影响。结果显示,PTPN_2基因敲除可以显著促进细胞的增殖,差异具有统计学意义。(p0.05)8、沙利度胺对PTPN_2过表达角质形成细胞增殖功能的影响应用MTS方法,检测沙利度胺对PTPN_2过表达角质形成细胞增殖功能的影响。结果显示,沙利度胺可以增加PTPN_2过表达角质形成细胞的增殖能力,差异具有统计学意义。(p0.05)9、PTPN_2对OSMR相关通路蛋白表达的影响(1)沙利度胺对PTPN_2基因敲除角质形成细胞Stat3和P-Stat3表达的影响。PTPN_2敲除角质形成细胞P-Stat3表达量明显增多,加入沙利度胺后,P-Stat3表达量减少。这与OSMR基因敲除对P-Stat3作用的影响正好相反,提示OSMR基因与PTPN_2可能位于同一条信号通路上,且OSMR基因位于PTPN_2上游,OSMR基因抑制PTPN_2的作用。PTPN_2基因敲除对Stat3的表达无明显影响。(2)PTPN_2基因敲除对角质形成细胞P-Stat5和Stat5表达量无影响,对Akt和P-Akt表达量无影响。(3)沙利度胺对PTPN_2基因过表达角质形成细胞Stat3和P-Stat3表达的影响。PTPN_2过表达角质形成细胞P-Stat3表达量减少,加入沙利度胺后,P-Stat3表达量增加。这与OSMR基因敲除对P-Stat3作用同向,再次验证了OSMR基因与PTPN_2可能位于同一条信号通路上,且OSMR基因位于PTPN_2上游,OSMR基因抑制PTPN_2的作用。PTPN_2基因过表达对Stat3的表达无明显影响。(4)PTPN_2过表达对角质形成细胞P-Stat5和Stat5表达量无影响,对Akt和P-Akt表达无影响。10、Stat3通路抑制剂对PTPN_2和OSMR基因敲除细胞增殖功能的影响加入STA-21后,PTPN_2基因敲除和OSMR基因敲除角质形成细胞的增殖功能都受到显著抑制。由此可见,PTPN_2基因和OSMR基因对细胞增殖的影响通过Stat3通路起作用。STA-21可以显著抑制,加入沙利度胺作用后的两组基因敲除细胞角质形成细胞的增殖能力。由此可见,沙利度胺可能通过Stat3通路,对PTPN_2基因敲除和OSMR基因敲除角质形成细胞增殖功能产生影响。结论:1、OSMR基因敲除降低角质形成细胞的增殖能力,增加凋亡水平。2、沙利度胺增加OSMR基因敲除角质形成细胞的增殖能力,降低凋亡水平,增加P-Stat3的表达水平。3、OSMR基因敲除上调角质形成细胞TC-PTP表达,作用于Stat3通路。4、沙利度胺可能作用于Stat3通路,通过对TC-PTP或其上游分子发生作用,对OSMR相关通路蛋白表达以及细胞的生物学功能产生影响。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R758.3
【部分图文】：
1 前言粉样变（Primary cutaneous amyloidosis，PCA）型的组织病理学改变为表皮棘细胞层增厚和角化物质沉积[1]。淀粉样物质的形成与角质形成细胞淀粉样变病例为散发，但是南美洲和台湾曾多次发性皮肤淀粉样变（Familial PCA，FPCA）[3]。基础是通过基因连锁分析和候选基因分析方法对台湾的FPCA家系进行了基因组扫描，发现了在连锁[3]。随后，通过对五号染色体存在连锁的基因定位于OSMR基因（oncostatin M receptor (OR基因突变位点如下图所示（图1.1），其中P694
2图1.2 OSMR基因突变导致信号通路传导障碍OSM可以诱导角质形成细胞迁移，引起表皮增生[7]。IL31是近年来发现的，与皮肤瘙痒密切相关[13]。在小鼠淋巴细胞中高表达IL31可以引起搔抓和
家族病例 3 10 8 3 2 2 2 2 2 1均值 8.08 6.58 5.17 4.50 4.17 2.60 2.60 2.00 1.60标准差 0.88 1.04 1.25 1.23 1.28 0.40 0.40 0.55 0.68沙利度胺剂量100mg/d 75mg/d 50mg/d注：应用视觉模拟评分方法(VAS)评价瘙痒强度，0 分-10 分3.2 验证 siRNA 转染方法敲除 OSMR 基因效率1、分别于小干扰RNA转染24、48、72小时提取细胞RNA，进行基因敲除验证。结果如下图，图中可见在RNA水平OSMR基因的敲除效率良好。图3.1为O基因扩增曲线，图3.2为RNA水平OSMR基因敲除效率。（* p<0.05，** p<0.01p<0.001，**** p<0.001，T检验）
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