遗传性对称性色素异常症致病基因的突变鉴定和功能分析

发布时间：2021-01-12 01:29

　　遗传性对称性色素异常症（Dyschromatosis Symmetrica Hereditaria，DSH；MIM#127400）又称Dohi对称性肢端色素沉着，是一种常染色体显性遗传性皮肤病。在日本人中报道较多，我国也有病例发现。我们发现的4个家系症状与既往报道相符，主要表现为为两侧手足背有对称性色素脱失斑和色素增加的褐黑色斑，部分病人可以向肢体近端发展延及前臂和小腿，腕、肘、膝关节也偶有累及，面部可有雀斑样损害。疾病通常起自幼年，平均发病年龄为6岁。日晒后皮损加重，一般无自觉症状。国内张学军等首先将DSH致病基因定位于染色体1q11-q21，日本学者新近证明DSH是由该区ADAR基因突变所致。 ADAR是一种双链RNA特异性腺苷酸脱氨酶，主要生物学功能包括RNA编辑和诱导蛋白质在核内的翻译。它能够作用于特定双链RNA结构和mRNA前体，将特殊位点上的腺苷（A）去氨基转变为次黄嘌呤（I），导致双链RNA结构不稳定及mRNA的降解。它广泛参与胚胎发育、中枢神经系统的神经递质传递、造血系统的发育、机体的免疫及抗病毒等各种发育、生理及病理过程。ADAR基因全长约30kb，共有15个外... 

【文章来源】：北京协和医学院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章页数】：108 页

【学位级别】：博士

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目录
中文摘要
ABSTRACT
第一部分 遗传性对称性色素异常症致病基因的定位研究
    前言
    材料与方法
        一、实验材料
            1. 家系资料
            2. 主要材料、试剂及配制
            3. 主要仪器设备
        二、实验方法
            1. 基因组 DNA的提取
            2. 短串联重复序列的PCR扩增
            3. 变性聚丙烯酞胺凝胶电泳及银染
            4. STR等位片段的分析
            5. 两点连锁分析
            6. 确定连锁标记在物理图谱中的位置
    实验结果
        一、遗传性对称性色素异常症家系临床资料
        二、遗传性对称性色素异常症致病基因的定位
            1. 个体的等位基因型
            2. 两点连锁分析
            3. 单体型的构建
            4. 1号染色体微卫星标记在物理图谱中的再定位
    讨论
第二部分 遗传性对称性色素异常症致病基因的突变研究
    前言
    材料与方法
        一、实验材料
            1. 家系资料
            2. 主要材料与试剂
        二、实验方法
            1. 外周血白细胞基因组DNA的提取
            2. ADAR基因全部外显子区及内含子-外显子交界区的扩增
            3. PCR扩增产物的纯化
            4. 纯化结果的定量检测
            5. 目的DNA片段测序
            6. DNA测序结果分析
            7. 4个家系中ADAR基因突变的酶切分析验证
    实验结果
        一、家系临床资料
        二、4个DSH家系中ADAR基因突变分析
    讨论
第三部分 遗传性对称性色素异常症的遗传学致病机制研究
    前言
    材料与方法
        一、外周血中单个核细胞的分离
        二、RNA的提取和反转录
        三、RT-PCR反应
            1. 外显子跳跃（exon skipping）的检测
            2. cDNA水平的突变检测
            3. 实时定量RT-PCR
    实验结果
        一、RNA质量鉴定
        二、外显子跳跃的检测
        三、基因组DNA与cDNA水平突变的比较
        四、患者单个核细胞中ADAR基因表达的相对定量
            1. 倍比稀释实验
            2. DSH患者ADAR基因相对表达量
    讨论
        一、遗传性对称性色素异常症的发病机制
        二、实时定量PCR的应用和分析
第四部分 ADAR基因在UVB诱导人黑色瘤细胞凋亡过程中的作用分析
    前言
    材料与方法
        一、实验材料
            1. 细胞系
            2. 菌株和质粒
            3. 主要试剂及试剂盒
            4. 主要器皿和仪器
        二、实验方法
            1. 质粒的构建与筛选
            2. 细胞培养
            3. 脂质体介导的A375细胞转染
            4. UVB处理转染后A375细胞
            5. RNA干扰操作过程
            6. 转导细胞的DNA结构分析
            7. ADAR基因抑制效率检测
            8. UVB处理诱导细胞凋亡
            9. Western印迹
    实验结果
        一、A375细胞中ADAR基因转录产物的检测
        二、ADAR蛋白的亚细胞定位
        三、ADAR蛋白在UVB处理的转染后 A375细胞内的定位
        四、逆转录病毒介导的ADAR基因特异性 RNA干扰质粒的鉴定
        五、抗性细胞克隆库形成
        六、实时定量 RT-PCR检测 ADAR基因抑制效率
        七、UVB诱导对 ADAR基因抑制后细胞凋亡的影响
    讨论
        一、ADAR蛋白的细胞定位
        二、ADAR基因表达抑制对UVB诱导A375细胞凋亡的影响
            1. 逆转录病毒载体介导的RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术
            2. UVB诱导的A375-siADAR细胞凋亡研究
学位论文总结
参考文献
文献综述
附录一 英汉名词对照及缩写
附录二 分析软件及常用网址
个人简历
致谢



本文编号：2971863