p21小干扰RNA对低浓度过氧化氢诱导的黑素细胞提前衰老和黑素传递的影响
发布时间：2021-02-27 11:54
目的:探讨小干扰RNA（siRNA）抑制p21表达对低浓度过氧化氢（H2O2）诱导的黑素细胞提前衰老的影响,以及黑素细胞提前衰老与黑素传递功能间的关系。方法:p21 siRNA序列转染黑素细胞,采用荧光显微镜、实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）及western blot检测抑制效率。将正常人黑素细胞分为对照组（阴性siRNA转染处理）、p21 siRNA组（p21 siRNA转染处理）、阴性siRNA+H2O2组（阴性siRNA转染24 h后加入400μmol/L H2O2处理）及p21 siRNA+H2O2组（p21 siRNA转染24 h后加入400μmol/L H2O2处理）。采用β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老;EdU细胞增殖检测细胞增殖能力;western blot检测各组p21和树突调节蛋白[RhoA、Rac1及细胞分裂周期蛋白42（Cdc42）]表...
【文章来源】：临床皮肤科杂志. 2020,49(06)北大核心
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
黑素细胞经p21 siRNA干扰后转染效率（×40)
EdU细胞增殖检测结果示p21 siRNA组黑素细胞EdU阳性细胞百分率[（20.60±0.56）%]较对照组[（18.68±0.16）%]增加，差异有统计学意义（P<0.05）。H2O2处理后，阴性siRNA+H2O2组黑素细胞增殖能力[（9.60±0.35）%]较对照组明显降低（P<0.05);p21 siRNA+H2O2组[（14.37±0.65）%]与阴性siRNA+H2O2组比较，差异有统计学意义（P<0.05）（图3C）。提示p21 siRNA预处理可改善H2O2诱导的黑素细胞增殖能力降低。2.5 各组RhoA、Rac1及Cdc42蛋白表达水平比较
越来越多的研究表明，氧化应激在白癜风发病中起关键作用[1,12]。许多与氧化应激相关的进行性或非进行性慢性病变被称为退行性疾病，这些疾病的病理已被证明是由持续的亚致死性氧化应激刺激，最终导致衰老和细胞退化[13]。因此推测持续的氧化应激下黑素细胞发生类似情况，氧化应激诱导黑素细胞衰老和退化。本课题组前期实验结果表明，持续低浓度亚致死性（400μmol/L)H2O2诱导黑素细胞提前衰老，且刺激黑素细胞提前衰老的H2O2浓度在白癜风皮损中H2O2升高的水平范围内（最高10-3 mol/L)[14]。上述证据支持白癜风可能是一种退行性疾病。因此，本研究推测在白癜风发病的早期阶段，H2O2可能不足以杀死黑素细胞，但通过诱导细胞衰老，干扰其活力和功能[15]。衰老细胞通常表现为β-半乳糖苷酶染色阳性率增加，细胞增殖能力降低和衰老相关蛋白表达水平上调（p16、p53及p21)[16]。本研究的前期实验发现低浓度H2O2处理黑素细胞可以经p53/p21途径诱导黑素细胞提前衰老。本研究通过干扰p21表达，抑制细胞衰老，经p21 siRNA处理，再由H2O2刺激后，与阴性siRNA+H2O2组比较，p21 siRNA+H2O2组β-半乳糖苷酶染色细胞阳性率降低、细胞增殖能力升高及衰老相关蛋白p21表达降低。提示通过转染抑制p21表达，可以改善H2O2处理后黑素细胞的提前衰老。黑素细胞在黑素小体中合成黑素，并通过细胞骨架将黑素转运至树突末端，随后将其转移至周围的角质形成细胞中[17-18]。黑素细胞-角质形成细胞的黑素转移是色素沉着的重要过程。黑素细胞在表皮细胞中占少数，需与周围角质形成细胞相互接触，因此黑素小体传递需要树突的延伸，从而实现有效的黑素转移[3]。黑素小体迁移过程中，黑素细胞树突向周围的角质形成细胞延伸，将黑素小体传递至角质形成细胞中。这种形态变化，与肌动蛋白和微管重组有关[19]。许多因素调节树突形态和细胞骨架成分（如肌动蛋白和微管），关键调节因子包括Rho家族蛋白，Rho家族的小GTP酶调节许多细胞活动，包括细胞极性、胞吞作用、囊泡运输、细胞周期调节、分化和基因转录[20]。其中3个小GTP酶发挥关键作用，包括RhoA、Rac1和Cdc42。已有研究确定RhoA诱导树突回缩和应力纤维形成[21],Rac1介导树突和板状伪足形成[22-24],Cdc42诱导丝状伪足和肌动蛋白微突形成[4,25]。另一方面，在神经细胞和神经源性细胞中（包括黑素细胞在内），RhoA刺激树突回缩，Rac1促进树突生长和延伸，Cdc42介导树突形成[26]。有研究报道皮损处黑素细胞树突回缩和数目减少[27]。活动期白癜风患者皮损边缘黑素细胞和周围角质形成细胞内的黑素小体计数显着下降[5]。因此，推测低浓度H2O2诱导黑素细胞提前衰老，损伤黑素细胞传递黑素小体的功能，参与白癜风发病。本研究中通过western blot检测树突关键调节因子———RhoA、Rac1和Cdc42的表达，研究低浓度H2O2对黑素传递的影响，发现低浓度H2O2处理黑素细胞诱导树突负性调节因子RhoA表达增高，正性调节因子Rac1和Cdc42表达降低。采用免疫荧光检测H2O2处理前后细胞骨架结构和黑素小体分布变化，发现H2O2处理后，细胞骨架F-actin荧光强度减弱及细胞树突缩短，黑素小体分布集中于胞核周围，树突末端分布减少。以上结果均表明，H2O2处理黑素细胞抑制树突形成和延伸，从而抑制黑素小体转移。为了进一步探讨黑素细胞提前衰老与黑素传递功能间的关系，本研究应用siRNA p21小干扰序列转染黑素细胞，抑制p21表达，抑制黑素细胞提前衰老，结果示p21 siRNA+H2O2组与阴性siRNA+H2O2组比较，RhoA表达降低，Rac1和Cdc42表达增高；免疫荧光示树突延长及树突黑素小体分布增多，提示H2O2诱导提前衰老的黑素细胞存在黑素小体传递功能障碍，黑素小体转移至周围的角质形成细胞减少，从而引起色素脱失。
【参考文献】：
期刊论文
[1]低浓度过氧化氢诱导人黑素细胞提早衰老[J]. 孙利,石家绮,丁书红,熊喜喜,李雪,鲁严. 南京医科大学学报(自然科学版). 2018(02)
[2]人表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养体外模型中黑素小体转运的观察[J]. 解士海,陈志强,马鹏程,卜今,周武庆,崔盘根,高建明,李玲珺,范卫新. 临床皮肤科杂志. 2006(05)
[3]白癜风皮损黑素细胞HMB-45、酪氨酸酶及其相关蛋白1的免疫组化研究[J]. 谭城,朱文元,鲁严. 临床皮肤科杂志. 2003(07)
本文编号：3054195
【文章来源】：临床皮肤科杂志. 2020,49(06)北大核心
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
黑素细胞经p21 siRNA干扰后转染效率（×40)
EdU细胞增殖检测结果示p21 siRNA组黑素细胞EdU阳性细胞百分率[（20.60±0.56）%]较对照组[（18.68±0.16）%]增加，差异有统计学意义（P<0.05）。H2O2处理后，阴性siRNA+H2O2组黑素细胞增殖能力[（9.60±0.35）%]较对照组明显降低（P<0.05);p21 siRNA+H2O2组[（14.37±0.65）%]与阴性siRNA+H2O2组比较，差异有统计学意义（P<0.05）（图3C）。提示p21 siRNA预处理可改善H2O2诱导的黑素细胞增殖能力降低。2.5 各组RhoA、Rac1及Cdc42蛋白表达水平比较
越来越多的研究表明，氧化应激在白癜风发病中起关键作用[1,12]。许多与氧化应激相关的进行性或非进行性慢性病变被称为退行性疾病，这些疾病的病理已被证明是由持续的亚致死性氧化应激刺激，最终导致衰老和细胞退化[13]。因此推测持续的氧化应激下黑素细胞发生类似情况，氧化应激诱导黑素细胞衰老和退化。本课题组前期实验结果表明，持续低浓度亚致死性（400μmol/L)H2O2诱导黑素细胞提前衰老，且刺激黑素细胞提前衰老的H2O2浓度在白癜风皮损中H2O2升高的水平范围内（最高10-3 mol/L)[14]。上述证据支持白癜风可能是一种退行性疾病。因此，本研究推测在白癜风发病的早期阶段，H2O2可能不足以杀死黑素细胞，但通过诱导细胞衰老，干扰其活力和功能[15]。衰老细胞通常表现为β-半乳糖苷酶染色阳性率增加，细胞增殖能力降低和衰老相关蛋白表达水平上调（p16、p53及p21)[16]。本研究的前期实验发现低浓度H2O2处理黑素细胞可以经p53/p21途径诱导黑素细胞提前衰老。本研究通过干扰p21表达，抑制细胞衰老，经p21 siRNA处理，再由H2O2刺激后，与阴性siRNA+H2O2组比较，p21 siRNA+H2O2组β-半乳糖苷酶染色细胞阳性率降低、细胞增殖能力升高及衰老相关蛋白p21表达降低。提示通过转染抑制p21表达，可以改善H2O2处理后黑素细胞的提前衰老。黑素细胞在黑素小体中合成黑素，并通过细胞骨架将黑素转运至树突末端，随后将其转移至周围的角质形成细胞中[17-18]。黑素细胞-角质形成细胞的黑素转移是色素沉着的重要过程。黑素细胞在表皮细胞中占少数，需与周围角质形成细胞相互接触，因此黑素小体传递需要树突的延伸，从而实现有效的黑素转移[3]。黑素小体迁移过程中，黑素细胞树突向周围的角质形成细胞延伸，将黑素小体传递至角质形成细胞中。这种形态变化，与肌动蛋白和微管重组有关[19]。许多因素调节树突形态和细胞骨架成分（如肌动蛋白和微管），关键调节因子包括Rho家族蛋白，Rho家族的小GTP酶调节许多细胞活动，包括细胞极性、胞吞作用、囊泡运输、细胞周期调节、分化和基因转录[20]。其中3个小GTP酶发挥关键作用，包括RhoA、Rac1和Cdc42。已有研究确定RhoA诱导树突回缩和应力纤维形成[21],Rac1介导树突和板状伪足形成[22-24],Cdc42诱导丝状伪足和肌动蛋白微突形成[4,25]。另一方面，在神经细胞和神经源性细胞中（包括黑素细胞在内），RhoA刺激树突回缩，Rac1促进树突生长和延伸，Cdc42介导树突形成[26]。有研究报道皮损处黑素细胞树突回缩和数目减少[27]。活动期白癜风患者皮损边缘黑素细胞和周围角质形成细胞内的黑素小体计数显着下降[5]。因此，推测低浓度H2O2诱导黑素细胞提前衰老，损伤黑素细胞传递黑素小体的功能，参与白癜风发病。本研究中通过western blot检测树突关键调节因子———RhoA、Rac1和Cdc42的表达，研究低浓度H2O2对黑素传递的影响，发现低浓度H2O2处理黑素细胞诱导树突负性调节因子RhoA表达增高，正性调节因子Rac1和Cdc42表达降低。采用免疫荧光检测H2O2处理前后细胞骨架结构和黑素小体分布变化，发现H2O2处理后，细胞骨架F-actin荧光强度减弱及细胞树突缩短，黑素小体分布集中于胞核周围，树突末端分布减少。以上结果均表明，H2O2处理黑素细胞抑制树突形成和延伸，从而抑制黑素小体转移。为了进一步探讨黑素细胞提前衰老与黑素传递功能间的关系，本研究应用siRNA p21小干扰序列转染黑素细胞，抑制p21表达，抑制黑素细胞提前衰老，结果示p21 siRNA+H2O2组与阴性siRNA+H2O2组比较，RhoA表达降低，Rac1和Cdc42表达增高；免疫荧光示树突延长及树突黑素小体分布增多，提示H2O2诱导提前衰老的黑素细胞存在黑素小体传递功能障碍，黑素小体转移至周围的角质形成细胞减少，从而引起色素脱失。
【参考文献】：
期刊论文
[1]低浓度过氧化氢诱导人黑素细胞提早衰老[J]. 孙利,石家绮,丁书红,熊喜喜,李雪,鲁严. 南京医科大学学报(自然科学版). 2018(02)
[2]人表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养体外模型中黑素小体转运的观察[J]. 解士海,陈志强,马鹏程,卜今,周武庆,崔盘根,高建明,李玲珺,范卫新. 临床皮肤科杂志. 2006(05)
[3]白癜风皮损黑素细胞HMB-45、酪氨酸酶及其相关蛋白1的免疫组化研究[J]. 谭城,朱文元,鲁严. 临床皮肤科杂志. 2003(07)
本文编号：3054195
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