BRAF～（V600E）突变基因对人黑素瘤细胞生长和侵袭能力的影响体内外研究

发布时间：2021-04-05 06:28

　　皮肤恶性黑素瘤是恶性程度较高的肿瘤之一，易于侵袭和转移。近年来发现，BRAF基因在人黑素瘤中存在高频率的突变，目前对其在黑素瘤形成、侵袭和转移中的作用尚不完全明确。本课题的目的是通过质粒介导的RNA干扰技术来研究BRAF突变基因在黑素瘤发展、侵袭和转移中的作用。首先，用脂质体转染试剂将3条构建并鉴定好的质粒载体(braf1、braf2和neg，其中braf1和braf2分别特异性针对人黑素瘤BRAF^V600E突变基因和BRAF基因，neg为阴性对照)转入黑素瘤细胞系A375细胞，并用含G418的培养液筛选阳性克隆。然后采用半定量RT-PCR和Westernblotting检测shRNA对BRAF基因的抑制作用。发现两个特异性质粒不同程度抑制BRAF基因的mRNA和蛋白的表达，其中以braf1的干扰效果最为明显，蛋白表达量下降90％。第二，我们将等量转入质粒（braf1和neg）及未转入质粒的肿瘤细胞，分别注入裸鼠皮下，观察干扰BRAF^V600E后，肿瘤细胞的成瘤情况，结果显示braf1质粒组肿瘤较其它组生长缓慢，瘤体重量较轻。在另一个动物实验... 

【文章来源】：北京协和医学院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章页数】：70 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
缩略语
中文摘要
Abstract
前言
第一部分 shRNA对人黑素瘤细胞BRAF基因沉默作用的体内外研究
    第一节 实验试剂及仪器
        一、主要试剂及溶液的配置
        二、主要仪器及耗材
    第二节 实验方法
        一、特异性发卡状shRNA编码序列的设计、合成、筛选、纯化、鉴定和测序
        二、质粒扩增和抽提
        三、质粒转染
        四、抗性克隆的筛选
        五、裸鼠成瘤实验
        六、荷瘤裸鼠治疗实验
        七、半定量RT-PCR
        八、Western blotting
    第三节 结果
        一、质粒体外转染效率
        二、裸鼠成瘤试验
        三、荷瘤鼠治疗试验
        四、蛋白定量
        五、shRNA在体外对A375细胞BRAF基因mRNA和蛋白表达的抑制效果
        六、裸鼠瘤体中BRAF基因mRNA和蛋白表达
    第四节 讨论
        一、siRNA导入细胞和稳定转染细胞的筛选
        二、干扰后BRAF基因的表达
    参考文献
第二部分 干扰BRAFV599E突变基因对人黑素瘤细胞体内外侵袭作用的影响机制初探
    第一节 实验试剂及仪器
        一、主要试剂及溶液的配置
        二、主要仪器及耗材
    第二节 实验方法
        一、质粒转染
        二、Transwell小室体外侵袭试验
        三、明胶酶谱
        四、肿瘤体内转移实验
        五、半定量RT-PCR
        六、Western blotting
    第三节 结果
        一、Transwell小室体外侵袭试验
        二、干扰BRAF基因对肿瘤的明胶酶酶活性的影响
        三、干扰BRAF基因对肿瘤MMP-2和VEGFmRNA和蛋白体内外表达的影响
        四、干扰BRAF基因对肿瘤细胞体内转移能力的影响
    第四节 讨论
参考文献
全文小结
论文相关综述
博士期间发表文章及参加学术活动情况
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]短发卡RNA对人黑素瘤细胞BRAF基因的沉默作用[J]. 韩永智,孙建方,周武庆,曾学思,姜祎群.  中华皮肤科杂志. 2006(11)
[2]西安、重庆两所医院20年皮肤恶性黑素瘤回顾[J]. 孙东杰,高天文,李春英,刘荣卿,李青,刘友生,刁庆春,何弘,黄高升,郝飞,马福成,柳凤轩,钟白玉,闫小初,刘东梅,李廷慧,刘玉峰.  中华皮肤科杂志. 2004(02)



本文编号：3119315