重组IL-24与IL-24-CN的构建、表达、纯化及其治疗恶性黑色素瘤的研究

发布时间：2017-04-19 15:07

  本文关键词：重组IL-24与IL-24-CN的构建、表达、纯化及其治疗恶性黑色素瘤的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：近年来,随着环境污染的日益严重、老龄化的加重及人们不良生活习惯的增多,癌症发病人数及因癌症死亡人数呈逐年递增的趋势。癌症转移是造成各种肿瘤疾病致死的主要原因,约有90%的癌症病人死于癌转移。传统的癌症治疗手段一般对人体存在较大的毒副作用,且并不总是有效。因此急需开发高效能低成本的抗肿瘤药物。白细胞介素(IL)-24是一种新型细胞因子,属于IL-10家族成员,体内外活性研究均显示其具有选择性诱导多种肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞生长的功能,对正常细胞没有毒性作用。IL-24的这一特点使其在治疗肿瘤疾病方面有较大的应用潜力,成为近年来研究的热点。Contortrostatin (CN)是从铜头蝮蛇毒素中提取的一种同源二聚体解离素多肽,通过其C-端柔性环区域的RGD序列与肿瘤细胞和血管内皮细胞的高亲和力相互作用,能够显著地抑制肿瘤细胞转移和肿瘤血管的生成,是唯一最具潜力用于治疗转移性癌症的蛇毒素提取物。本文对IL-24和IL-24-CN融合蛋白在大肠杆菌中的重组表达及生物学活性进行了研究。 为了实现IL-24在大肠杆菌中的非融合表达,我们优化了IL-24mRNA翻译起始区(TIR)的二级结构,使mRNA TIR序列自由能由-22.0kcal/mol降低为-9.07kcal/mol,降低了约2.4倍,促进了较为疏松的二级结构的形成。通过PCR、酶切和连接,我们成功将IL-24突变基因克隆至pET-32a(+)。将重组质粒转化大肠杆菌,诱导表达结果显示与非优化(几乎没有表达)相比IL-24的表达水平显著提高,达菌体总蛋白的26%。我们通过两步包涵体洗涤、变复性和离子交换色谱纯化获得了纯度约为93%的nrIL-24。 为了增强IL-24的抗肿瘤活性,我们构建了IL-24-CN融合表达质粒pET32a-IL24-CN,并将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta-gami B(DE3)pLysS,诱导表达结果显示融合蛋白以可溶形式表达,可溶表达量达破碎上清的39.3%。我们建立了融合蛋白的分离纯化及标签切除工艺,获得了较高纯度的IL-24-CN。 本文分别采用MTT比色法、流式细胞术、伤口愈合实验和Trans well实验对重组蛋白的活性进行了验证,并初步分析了IL-24-CN抗肿瘤活性机制。 (1)MTT结果显示nrIL-24和IL-24-CN可呈浓度依赖型抑制恶性黑色素瘤A375细胞的生长,IL-24-CN表现出更高的抑制活性。为了进一步确定这种生长抑制作用与诱导凋亡作用的关系,我们进行了annexin V/PI双染实验,与对照组相比nrIL-24和IL-24-CN均能显著诱导A375细胞的凋亡,诱导凋亡率分别为16.8%和26.8%。实验结果表明nrIL-24和IL-24-CN可通过诱导A375细胞的凋亡抑制其生长,且IL-24-CN对A375细胞具有更强的抑制活性。 (2)我们首先采用伤口愈合实验分析了重组蛋白对A375细胞迁移的影响,结果表明,24h后以PBS处理的对照组划痕明显变小,与实验组相比A375细胞有明显的迁移,迁移率为33.07%。以nrIL-24处理的A375细胞划痕距离也有减小,迁移率为26.59%。以IL-24-CN处理的肿瘤细胞迁移距离最小,迁移率为16.82%,说明IL-24-CN对肿瘤细胞的迁移有显著的抑制作用且活性强于nrIL-24,迁移抑制率为49.14%。 (3) Transwell实验验证了上述结果,nrIL-24对A375的迁移和侵袭都有一定的抑制作用,相对抑制率分别为24.68%和13.56%。IL-24-CN对A375细胞的迁移和侵袭有明显的抑制作用,相对抑制率分别为51.95%和45.76%。 (4)通过检测肿瘤细胞与已包被nrIL-24和IL-24-CN的平板的结合能力,反映重组蛋白对肿瘤细胞的亲和力,同时设置只包被BSA的孔板为对照。只包被BSA的孔板几乎没有A375细胞的粘附,包被重组蛋白nrIL-24的孔板有少许A375细胞被粘附于板底,包被IL-24-CN的孔底对A375细胞的粘附数量显著增多,这也说明CN对肿瘤细胞有较强的亲和力,通过与CN的融合表达可提高IL-24到肿瘤细胞表面的靶向性。 综上所述,本研究通过非融合表达策略实现了重组IL-24的高效制备,纯化获得的nrIL-24可显著诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞生长,且对肿瘤细胞的迁移和侵袭有一定抑制作用。本研究还构建了IL-24-CN的可溶表达系统,初步建立了重组蛋白的纯化工艺,IL-24-CN具有比nrIL-24更强的肿瘤生长抑制活性,且可显著抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭,说明CN与IL-24的融合表达策略对提高其抗肿瘤活性有协同作用。本研究的工作为IL-24其进一步的活性研究及应用于癌症治疗奠定了基础。
【关键词】：白细胞介素-24 Contortrosatin 重组表达 纯化 抗肿瘤
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.5
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第1章 前言12-30
• 1.1 癌症研究现状及治疗策略12-18
• 1.1.1 癌症的特点12-13
• 1.1.2 肿瘤细胞的转移机制13-15
• 1.1.3 几种重要的肿瘤转移调控因子15-16
• 1.1.4 癌症的治疗策略16-17
• 1.1.5 癌症治疗的启示17-18
• 1.2 MDA-7/IL-24研究进展18-24
• 1.2.1 MDA-7/IL-24概述18
• 1.2.2 MDA-7/IL-24的表达特性18-20
• 1.2.3 IL-24的受体与信号转导20
• 1.2.4 IL-24的功能20-23
• 1.2.5 IL-24肿瘤治疗应用进展23-24
• 1.3 解离素研究进展24-27
• 1.3.1 解离素的分类24
• 1.3.2 解离素的结构24-25
• 1.3.3 解离素的功能25-27
• 1.4 CN研究进展27-29
• 1.4.1 CN的抗肿瘤活性27-28
• 1.4.2 CN抗肿瘤应用研究现状28-29
• 1.5 本课题的研究目的、内容及意义29-30
• 1.5.1 研究目的和意义29
• 1.5.2 研究内容29-30
• 第2章 重组IL-24的构建30-45
• 2.1 引言30
• 2.2 材料和方法30-39
• 2.2.1 载体和宿主菌30-31
• 2.2.2 主要仪器31
• 2.2.3 主要试剂31-32
• 2.2.4 实验常用试剂的配制32-33
• 2.2.5 实验方法33-39
• 2.3 结果39-44
• 2.3.1 密码子优化降低mRNA TIR二级结构自由能39-40
• 2.3.2 PCR扩增目的基因40
• 2.3.3 单克隆的筛选40-41
• 2.3.4 重组质粒测序41
• 2.3.5 nrIL-24的诱导表达41-42
• 2.3.6 包涵体的变性和复性42-43
• 2.3.7 nrIL-24的纯化43
• 2.3.8 重组蛋白浓度测定43-44
• 2.4 讨论44-45
• 第3章 重组IL-24-CN的构建45-56
• 3.1 引言45
• 3.2 材料和方法45-49
• 3.2.1 载体和宿主菌45
• 3.2.2 主要仪器45
• 3.2.3 主要试剂45
• 3.2.4 实验常用试剂的配制45
• 3.2.5 实验方法45-49
• 3.3 结果49-54
• 3.3.1 PCR扩增获得IL-24-CN编码基因49-50
• 3.3.2 单克隆的筛选50
• 3.3.3 pET32a-IL24-CN的序列测定50-51
• 3.3.4 pET32a-IL24-CN的诱导表达51
• 3.3.5 融合蛋白的纯化51-52
• 3.3.6 融合蛋白标签的切除52-54
• 3.4 讨论54-56
• 第4章 活性检测56-67
• 4.1 引言56
• 4.2 材料和方法56-60
• 4.2.1 材料56
• 4.2.2. 主要仪器56-57
• 4.2.3 主要试剂57
• 4.2.4 实验方法57-60
• 4.3 实验结果60-65
• 4.3.1 MTT法检测重组蛋白对A375细胞增殖能力的影响60-61
• 4.3.2 重组蛋白对A375细胞的诱导凋亡活性61
• 4.3.3 重组蛋白对A375细胞迁移和侵袭的影响61-64
• 4.3.4 IL-24-CN对A375细胞粘附作用64-65
• 4.4 讨论65-67
• 第5章 结论与展望67-68
• 5.1 结论67
• 5.2 展望67-68
• 参考文献68-75
• 致谢75-76
• 科研成果76

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 董兵;朱毅敏;;癌症分子靶向治疗的研究现状[J];癌症;2010年03期

2 徐永强;蛇毒抗肿瘤转移的研究现状[J];中国临床药理学与治疗学;2002年05期

3 张晔;芮景;;蛇毒解离素抗肿瘤研究进展[J];中国临床药理学与治疗学;2007年09期

4 吴菲;林国桢;张晋昕;;我国恶性肿瘤发病现状及趋势[J];中国肿瘤;2012年02期

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本文编号：316523