不同地区孢子丝菌临床分离株基因分型及药物敏感性研究

发布时间：2017-04-27 00:06

  本文关键词：不同地区孢子丝菌临床分离株基因分型及药物敏感性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的： 对我国不同地区孢子丝菌的临床分离株进行基因分型和系统进化分析；研究双相型真菌球形孢子丝菌分别在菌丝相（30℃、35℃）和酵母相（35℃）两种形态下对8种抗真菌药物的敏感性，了解不同地区球形孢子丝菌的药物敏感性是否有差异。 方法： 1、分别选取吉林省、广东省、四川省、北京市、江苏省地区球形孢子丝菌株共5株，分别采用CTAB法、异硫氰酸胍沸腾法、碱裂解法、试剂盒法提取DNA，检测其核酸浓度及纯度值，并利用PCR扩增，比较产物条带亮度，确定孢子丝菌DNA最佳提取方法。 2、对43株临床分离株的钙调蛋白基因（CAL)进行核酸测序，并将其序列在Genbank数据库上比对，利用MEGA5.0软件，采用邻接法（neighbor-joining，NJ）进行系统进化分析。 3、采用美国临床和实验室标准化研究所（CLSI）制定的微量液基稀释法M-38A和M27-A2，并稍作修改后，对43株经鉴定为球形孢子丝菌菌株的两种形态（菌丝相及酵母相）在不同温度（30℃、35℃）进行体外药物敏感试验，测定的抗真菌药物为：氟康唑、伊曲康唑、特比萘芬、酮康唑、益康唑、伏立康唑、咪康唑、两性霉素B。计算其最小抑菌浓度（MIC），MIC50、MIC90、GM，利用统计学软件比较其差异性。 结果： 1、比较CTAB法、异硫氰酸胍沸腾法、碱裂解法、试剂盒法四种方法所提取的球形孢子丝菌的DNA，结果显示碱裂解法提取的DNA纯度最好。 2、使用CL1，CL2A引物对43株临床孢子丝菌基因组DNA扩增后可获得约770bp左右大小的CAL基因片段，经序列测定和比对后，确定43株临床分离孢子丝菌均为球形孢子丝菌。系统进化树结果显示，各地区球形孢子丝菌与文献已确证的球形孢子丝菌（AM399002、AM39004、AM399005、AM399015、KC190217、KC121565、KC190218、KC190219、AM399015、GU456632）位于同一group中，且分为两个cluster，推测球形孢子丝菌可能存在两个亚组。 3、体外双相不同温度药物敏感性试验结果： （1）TBF抗真菌活性最好，MIC值0.03-0.25μg/ml，GM值为0.04μg/ml，其次为MCZ、ECZ和KCZ的抗真菌活性较好，MIC值分别为0.03-1.0μg/ml、0.03-1.0μg/ml、0.03-4.0μg/ml，但是不同温度及不同时相MIC值稍有波动; （2）统计学结果显示，，不同地区药敏结果差别均无统计学意义（P0.01）。菌丝相不同温度（30℃、35℃）及酵母相35℃MIC值差别有统计学意义（P0.05），菌丝相的MIC值较酵母相的高，其中MIC值菌丝相35℃介于菌丝相30℃和酵母相之间。 结论： 1、碱裂解法是一种适于球形孢子丝菌DNA提取的简便方法。 2、中国各个省市地区均以球形孢子丝菌为主要致病菌种，多数来源于环境，球形孢子丝菌的基因型别无明显地区差异。 3、不同地区球形孢子丝菌对TBF最为敏感，其次为MCZ、ECZ、KCZ和ICZ，而对FCZ、VCZ及AMB都显示出了耐药性，地区差异并不明显。球形孢子丝菌体外药敏试验受温度和时相影响，除TBF外，菌丝相MIC值普遍较酵母相高，其中菌丝相30℃MIC值最高，依次为菌丝相35℃、酵母相35℃。
【关键词】：球型孢子丝菌 钙调蛋白基因 药物敏感性试验
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R440;R756
【目录】：

• 前言4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-14
• 第1章 绪论14-15
• 第2章 综述15-21
• 2.1 申克孢子丝菌复合体的基因分型15-19
• 2.1.1 基因分型与地理分布的关系17
• 2.1.2 基因分型和临床型别的关系17-18
• 2.1.3 基因分型和药物敏感性关系18-19
• 2.2 展望19-21
• 第3章 球形孢子丝菌基因组 DNA 提取方法优化21-30
• 3.1 材料与方法21-24
• 3.1.1 实验材料21-22
• 3.1.2 实验方法22-24
• 3.2 实验结果24-28
• 3.2.1 DNA 浓度及纯度24-27
• 3.2.2 PCR 扩增27
• 3.2.3 琼脂凝胶电泳27-28
• 3.3 小结28
• 3.4 讨论28-30
• 第4章 不同地区孢子丝菌的基因分型和系统进化分析30-38
• 4.1 材料与方法30-31
• 4.1.1 实验材料30
• 4.1.2 实验方法30-31
• 4.2 实验结果31
• 4.3 讨论31-38
• 第5章 不同地区球形孢子丝菌药物敏感性试验38-48
• 5.1 材料与方法38-42
• 5.1.1 实验材料38-39
• 5.1.2 实验方法39-42
• 5.2 统计学方法42-43
• 5.3 结果43-47
• 5.3.1 43株球形孢子丝菌菌丝相及酵母相药敏结果43
• 5.3.2 43株球形孢子丝菌不同地区药敏结果MIC值比较43
• 5.3.3 43株球形孢子丝菌双相、不同温度药敏结果MIC值比较43-47
• 5.4 讨论47-48
• 第6章 结论48-49
• 参考文献49-55
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果55-56
• 致谢56

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 白永宏;陈国梁;闫冬;张向前;;几种食用菌子实体总DNA提取方法的比较研究[J];安徽农业科学;2011年19期

2 夏建新;王延龙;王平凡;张凤华;张民夫;金学洙;;皮肤播散性孢子丝菌病1例[J];临床皮肤科杂志;2006年11期

3 苏海辉;罗庆录;李若瑜;;不同抗真菌药物对申克孢子丝菌的体外敏感性研究进展[J];中国麻风皮肤病杂志;2006年07期

4 谭静文;刘伟;万U

本文编号：329496