Rab23对UVB诱导角质形成细胞自噬的调节作用及机制研究

发布时间：2017-04-27 16:12

  本文关键词：Rab23对UVB诱导角质形成细胞自噬的调节作用及机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的光线性角化病是一种临床常见的皮肤癌前期病变,常见于中老年人,可发展为皮肤鳞状细胞癌。目前光线性角化病的发病机制尚未完全阐明,长期反复日光曝露是最常见的诱发因素。以往研究认为光线性角化病的发病主要与UVB造成的基因突变及免疫抑制密切相关,近年来研究发现自噬在其中也起到了重要作用,结合本课题前期研究发现同时Rab23在光线性角化病中高表达,我们推测Rab23很可能参与了光线性角化病中自噬的调节。因此,本实验研究重点在Rab23对UVB诱导角质形成细胞自噬的调节作用,并对其调节的机制进行初步探讨。方法免疫组化检测光线性角化病与正常皮肤组织中Rab23及自噬相关蛋白LC3、Beclin1的表达;细胞水平的实验以UVB照射的Ha Ca T细胞为模型,运用蛋白免疫印迹检测Rab23及自噬相关蛋白Beclin1、LC3的表达及Rab23调控自噬的相关信号通路ERK1/2、m TOR、AKT的表达水平及验证相关通路之间关系;免疫荧光共聚焦观察UVB是否可诱导角质形成细胞自噬的产生及Rab23与LC3是否存在共定位。结果1.Rab23及自噬相关蛋白在光线性角化病中表达水平:免疫组化检测结果显示Rab23和自噬LC3、Beclin1在光线性角化病表皮中高表达,而在正常皮肤组织中仅在基底膜带低表达或不表达。2.UVB可诱导角质形成细胞自噬水平升高:免疫荧光及蛋白免疫印迹结果显示,在剂量为30m J/cm2UVB照射时自噬水平达到最高,之后随着剂量的增加自噬水平逐渐降低,同时蛋白免疫印迹结果显示Rab23与自噬相关蛋白有着一致性的变化。随后用30m J/cm2UVB照射Ha Ca T细胞,分别于0h、2h、6h、12h检测自噬相关蛋白的表达水平,结果显示在2h时自噬水平最高,随着时间的延长自噬水平逐渐下降。为了进一步观察Rab23与自噬的相关性,我们利用自噬激动剂雷帕霉素及自噬抑制剂氯喹刺激Ha Ca T细胞后,检测Rab23与自噬相关蛋白表达水平的变化,结果显示二者仍有着一致性的变化,高度提示Rab23参与了UVB诱导的自噬过程。3.自噬对UVB照射后Ha Ca T细胞存活率的影响:CCK8检测30m J/cm2UVB照射后自噬促进剂雷帕霉素及抑制剂氯喹对角质形成细胞存活率的影响,结果显示促进自噬可使存活率提高,而抑制自噬则降低存活率。4.Rab23对自噬的调控作用:蛋白免疫印迹方法检测30m J/cm2UVB照射后2h在稳定表达不同水平Rab23的Ha Ca T细胞中的自噬水平,结果显示Rab23过表达后自噬相关蛋白表达水平升高,而干涉Rab23的表达后自噬相关蛋白表达水平降低,同样免疫荧光结果也显示在Rab23过表达的细胞中LC3荧光数目较对照组增多。5.Rab23调控自噬的机制:免疫荧光共聚焦结果显示Rab23与自噬相关蛋白LC3并不存在共定位关系。通过蛋白免疫印迹检测调控自噬相关通路及Rab23对这些通路的影响,结果显示,UVB照射后ERK1/2的通路激活及m TOR通路的抑制受Rab23的调节,过表达Rab23后可促进ERK的表达抑制m TOR的表达,且干涉ERK后m TOR的表达升高。结论本研究从组织学方面发现自噬相关蛋白与Rab23同时在光线性角化病中均高表达且二者存在一定的相关性为着眼点,以UVB照射角质形成细胞为模型,发现UVB可诱导角质形成细胞自噬水平升高,促进自噬可提高UVB照射后角质形成细胞的存活率,且Rab23在该过程中有着重要的调节作用,该调节作用的可能分子学机制是通过ERK或ERK/m TOR通路实现的,而非直接参与自噬中的膜转运过程。
【关键词】：Rab23 自噬 ERK1/2 mTOR 光线性角化病
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R758.69
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-14
• 前言14-15
• 文献回顾15-22
• 1.实验材料22-29
• 1.1 实验对象22
• 1.2 实验所需主要试剂22-24
• 1.3 实验所需主要仪器24-25
• 1.4 试剂配置25-29
• 2.实验方法29-40
• 2.1 免疫组化检测光线性角化病与正常皮肤中Rab23 及自噬相关蛋白LC3、Beclin1 的表达29-30
• 2.2 细胞复苏及培养30-31
• 2.3 CCK-8 检测自噬对UVB照射后角质形成细胞存活率的影响31
• 2.4 不同剂量UVB对细胞自噬的影响的免疫荧光共聚焦检测31-32
• 2.5 蛋白免疫印迹检测不同剂量UVB对细胞自噬及Rab23 的影响32-34
• 2.6 蛋白免疫印迹检测UVB照射后角质形成细胞后不同时间点自噬相关蛋白及Rab23 的表达34-35
• 2.7 稳转细胞系的构建35
• 2.8 Rab23 对UVB诱导自噬的调节作用的蛋白免疫印迹检测35-36
• 2.9 自噬抑制剂氯喹、自噬促进剂雷帕霉素对细胞自噬及Rab23 影响的蛋白免疫印迹检测36-37
• 2.10 免疫荧光共聚焦观察Rab23 与LC3 的定位关系及Rab23 对自噬的影响37
• 2.11 UVB照射后HaCaT细胞内信号转导通路的蛋白免疫印迹检测37-38
• 2.12 蛋白免疫印迹检测UVB照射后稳定表达不同Rab23 的HaCaT细胞株中ERK、mTOR的表达38-39
• 2.13 蛋白免疫印迹检测UVB照射后稳定表达野生型Rab23 的角质形成细胞中干涉ERK对mTOR表达的影响39-40
• 2.14 实验数据分析40
• 3.结果40-49
• 3.1 Rab23 及自噬相关蛋白LC3、Beclin1 在光线性角化病皮损及和正常皮肤组织中的表达40
• 3.2 UVB诱导角质形成细胞自噬水平升高40-41
• 3.3 不同剂量UVB照射角质形成细胞后Rab23 及自噬相关蛋白LC3、Beclin1 的表达变化41-42
• 3.4 UVB照射角质形成细胞后 0h、2h、6h、12h自噬相关蛋白LC3、beclin1及Rab23 的表达变化42-43
• 3.5 自噬促进剂雷帕霉素及自噬抑制剂氯喹对UVB照射角质形成细胞后Rab23、LC3、beclin1 的变化43
• 3.6 促进或抑制自噬对UVB照射角质形成细胞存活率的影响43-44
• 3.7 Rab23 对UVB诱导的角质形成细胞自噬的调控作用44-46
• 3.8 Rab23 调控角质形成细胞自噬机制的探讨46-49
• 4.讨论49-54
• 小结54-56
• 参考文献56-63
• 个人简历和研究成果63-64
• 致谢64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 程勇;徐振平;孙爱军;;自噬的分子医学研究进展[J];中国分子心脏病学杂志;2011年02期

  本文关键词：Rab23对UVB诱导角质形成细胞自噬的调节作用及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：330956