NB-UVB对角质形成细胞角蛋白17表达的调控作用及其机制研究

发布时间：2017-05-03 18:06

  本文关键词：NB-UVB对角质形成细胞角蛋白17表达的调控作用及其机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的银屑病是一种临床常见的易复发的慢性炎性皮肤病，其发病率较高，全球发病率约为0.1-4.0%。目前银屑病的发病机制尚不十分明确，与环境和遗传等多种因素有关。以往研究发现银屑病相关角蛋白17（K17）在银屑病皮损区呈特异性高表达，并且通过“K17-T细胞-细胞因子”自身免疫环路的形式参与银屑病的发病和疾病的进展。窄谱中波紫外线（NB-UVB）是临床常用的治疗银屑病的方法，具有安全、有效、副作用小的特点。NB-UVB治疗银屑病的作用机制可能与诱导T细胞凋亡有关，但NB-UVB对表皮角质形成细胞的具体作用，尤其对K17表达的影响尚不清楚，本研究通过体内及体外实验探讨不同剂量NB-UVB对角质形成细胞K17表达的调控作用及其机制。 方法不同剂量NB-UVB照射角质形成细胞细胞系，照射后培养12h用AnnexinV/PI检测细胞凋亡，照射后6、12、24h用CCK8法测定细胞活性，透射电镜观察细胞骨架变化，Real-time PCR和Western-blot用于检测K17mRNA和蛋白表达影响以及其对ERK1/2、STAT3、STAT1、P38、AKT、P65磷酸化活性的影响；分离培养原代角质形成细胞，采用荧光实时定量PCR、Western印迹以及K17免疫荧光等方法对以上结果进行验证；采用咪喹莫特诱导银屑病样皮炎小鼠模型，HE染色检测不同剂量NB-UVB照射后表皮病理变化，荧光实时定量PCR、Western印迹、K17免疫荧光和免疫组化检测NB-UVB对小鼠表皮组织K17mRNA和蛋白表达的影响。 结果细胞凋亡检测发现角质形成细胞耐受NB-UVB剂量范围为0-400mJ/cm2，该剂量范围内进一步行细胞增殖实验，发现低剂量（100mJ/cm2）NB-UVB照射可以促进角质形成细胞的增殖和K17表达，而高剂量（400mJ/cm2）NB-UVB照射则具有抑制细胞增殖和K17表达的作用，差异有统计学意义（P0.05和P0.05）。通过对NB-UVB照射后相关信号通路进行筛查，发现100mJ/cm2NB-UVB照射可以上调角质形成细胞ERK1/2、STAT3的磷酸化水平，，而400mJ/cm2NB-UVB照射后ERK1/2、STAT3的磷酸化水平明显下降，阻断这一信号通路可以抑制低剂量NB-UVB对K17的上调。不同剂量NB-UVB照射对原代角质形成细胞K17表达影响与HaCaT细胞系结果一致；动物实验筛选出BALB/C小鼠NB-UVB的最小红斑量（MED）为350mJ/cm2，分别予低剂量（100mJ/cm2隔日一次）和高剂量（300mJ/cm2为初始照射剂量，隔日照射一次，每次增加50mJ/cm2，累计剂量1500mJ/cm2）NB-UVB照射，高剂量NB-UVB照射后表皮角化过度、角化不全等病理变化得到改善，K17表达明显减低，低剂量NB-UVB照射对皮损改善和K17表达无明显影响。 结论低剂量NB-UVB照射可刺激角质形成细胞增殖和K17表达，而较高剂量NB-UVB照射则抑制细胞增殖和K17表达，低剂量NB-UVB引起K17表达的上调现象受到ERK1/2及STAT3通路的调控，而高剂量NB-UVB则抑制ERK1/2及STAT3的活化，引起K17表达的进一步降低，不同剂量NB-UVB照射可引起角质形成细胞截然相反的生物学行为改变，这一现象与信号通路的状态相关。临床NB-UVB治疗银屑病常以最小红斑量的50-70%为起始剂量，当NB-UVB大于临床起始照射剂量，可以抑制细胞增殖及K17表达，而低于临床起始照射剂量时，不能起到抑制细胞增殖和K17表达的作用，与本研究实验结果一致。我们的研究揭示了NB-UVB治疗银屑病的一个新的作用机制：一定剂量的NB-UVB可通过抑制角质形成细胞中K17表达来发挥作用，而这种作用机制可能是通过抑制ERK1/2及STAT3通路的活化来实现的。由此可见，NB-UVB可从不同的环节抑制或阻断“K17-T细胞-细胞因子环路”，有效的阻止正反馈环路的形成，从而达到有效的治疗银屑病的目的。
【关键词】：窄谱中波紫外线 角质形成细胞 角蛋白17 细胞增殖 银屑病
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R758.63
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-15
• 文献回顾15-20
• 1 材料20-26
• 1.1 主要仪器设备20-21
• 1.2 主要试剂21-23
• 1.3 主要试剂配制23-26
• 2 方法26-38
• 2.1 HaCaT 细胞复苏26-27
• 2.2 细胞传代27
• 2.3 NB-UVB 照射方法及剂量选择27
• 2.4 HaCaT 细胞耐受 NB-UVB 剂量范围的确定27-28
• 2.5 细胞增殖的 CCK-8 检测28
• 2.6 原代角质形成细胞分离及培养28-29
• 2.7 NB-UVB 对角质形成细胞 K17 mRNA 表达水平的影响29-31
• 2.8 NB-UVB 照射后角质形成细胞 K17 蛋白的 Western-blot 检测31-32
• 2.9 NB-UVB 照射后角质形成细胞 K17 表达的细胞免疫荧光染色检测32-33
• 2.10 NB-UVB 照射后角质形成细胞 ERK1/2 信号转导通路的 Western-blot 检测33
• 2.11 NB-UVB 照射后角质形成细胞信号转导通路的 Western-blot 检测33-34
• 2.12 抑制 ERK1/2 和 STAT3 活性后 NB-UVB 对 K17 蛋白表达的影响34-35
• 2.13 银屑病样皮炎 Balb/c 小鼠模型的构建35
• 2.14 Balb/c 小鼠照射 NB-UVB 的最小红斑量测定35
• 2.15 银屑病样皮炎 Balb/c 小鼠模型 NB-UVB 照射后耳廓变化35
• 2.16 银屑病样皮炎 Balb/c 小鼠模型 NB-UVB 照射后表皮形态学改变35-36
• 2.17 银屑病样皮炎 Balb/c 小鼠模型 NB-UVB 照射后 K17 表达的免疫组化观察36
• 2.18 银屑病样皮炎 Balb/c 小鼠模型 NB-UVB 照射后 K17 表达的免疫荧光观察36-37
• 2.19 NB-UVB 照射后小鼠耳部组织 K17 蛋白表达的 Western-blot 检测37-38
• 2.20 NB-UVB 照射后小鼠耳部组织 K17 mRNA 表达的 Real-time PCR 检测38
• 2.21 细胞超微结构的透射电子显微镜观察38
• 2.22 实验数据分析方法38
• 3 结果38-50
• 3.1 NB-UVB 照射对角质形成细胞凋亡和增殖活性的影响38-40
• 3.2 不同剂量 NB-UVB 照射角质形成细胞后细胞形态及超微结构的变化40-41
• 3.3 不同剂量 NB-UVB 照射后 6、12、24h 角蛋白 17 表达变化41-43
• 3.4 不同剂量 NB-UVB 对原代角质形成细胞 K17 mRNA 及蛋白表达的影响43-45
• 3.5 不同剂量 NB-UVB 照射角质形成细胞后 K17 相关信号转导通路变化45-46
• 3.6 NB-UVB 影响 K17 表达的分子机制46-47
• 3.7 Balb/c 小鼠最小红斑量的筛选及银屑病样皮炎小鼠模型的构建47-49
• 3.8 NB-UVB 对银屑病样皮炎小鼠模型皮损 K17 表达的影响49-50
• 4 讨论50-54
• 小结54-55
• 参考文献55-62
• 个人简历和研究成果62-63
• 致谢63

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