白癜风患者外周血Treg细胞中HO-1表达、作用及机制研究

发布时间：2017-06-09 13:01

  本文关键词：白癜风患者外周血Treg细胞中HO-1表达、作用及机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景:白癜风是一种以表皮黑素细胞破坏为特征的色素脱失性疾病,其确切病因及发病机制尚不明确。目前认为,白癜风是多基因遗传为基础、多因素共同参与的疾病。关于黑素细胞被破坏机制主要有自身免疫、氧化应激、遗传易感、黑素细胞凋亡、神经精神和角质形成细胞功能异常等学说。近年研究表明,氧化应激是白癜风发病的诱导环节,而CD8+T则是发病的关键效应环节。CD4+CD25+Treg细胞是调控机体不适当或者过强免疫应答的关键机制之一,通过抑制效应性CD4+和CD8+T细胞的功能,防止自身免疫性疾病的发生。研究发现,Treg细胞的主要功能分子Foxp3、IL-10及TGF-β等是白癜风发病的易感基因,白癜风患者CD4+CD25+Treg细胞数量及功能异常,且体内过继回输Treg细胞可使白癜风小鼠脱色毛发复色。然而,目前尚缺乏针对白癜风患者Treg细胞数量及功能异常的上游调控机制研究。因此,阐明白癜风Treg细胞数量及功能受损的原因,对于进一步认识Treg细胞在白癜风发病中的作用,具有重要的意义。血红素氧合酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)又称HSP32,作为一种压力反应蛋白,一般在炎症因子、缺氧、重金属暴露等条件下诱导产生。研究表明,HO-1催化血红素降解为胆绿素、CO及Fe2+,具有抗氧化、抗细胞增殖及抗凋亡的作用。我课题组前期研究发现,白癜风患者血清中HO-1活性明显降低,与IL-2的表达呈明显负相关,从而增强CD8+T细胞介导的免疫反应,是导致白癜风黑素细胞免疫损伤的重要机制。而最新研究证实HO-1可增强CD4+CD25+Treg细胞免疫抑制功能,从而保护机体免遭T细胞免疫损伤。由此我们推测:白癜风患者HO-1活性降低可能导致Treg细胞免疫抑制功能受损,从而引发CD8+T细胞的功能亢进,最终导致黑素细胞的免疫损伤及白斑形成。方法:1.收集泛发型进展期白癜风患者与健康正常人的外周血样本,分离获取PBMC,利用流式细胞术鉴定CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞占CD4+T细胞的比例,明确白癜风患者外周血中Treg细胞的比例变化;2.流式细胞术分选出患者、健康正常人CD4+CD25+CD127lowTreg细胞,在CD3/CD28抗体包被及可溶性IL-2存在条件下,孵育后检测Treg细胞的增殖情况,明确患者Treg细胞增殖功能;分选出的Treg细胞分别与第三方健康人PBMC共孵育后检测PBMC的增殖水平,明确患者Treg细胞的抑制功能;3.采用ELISA方法检测血清中Treg细胞功能相关分子的含量,在分子水平上明确患者Treg细胞的功能;4.利用流式细胞术检测Treg细胞膜上抑制功能分子及胞内炎症因子的表达,进一步明确患者Treg细胞的功能改变;5.通过流式细胞术鉴定Treg细胞中HO-1的平均荧光强度及HO-1阳性的Treg细胞比例,明确HO-1在患者中的表达;利用ELISA检测血清中HO-1及其催化产物的含量,进一步明确HO-1在白癜风患者中的活性。6.利用患者、正常人血清分别与健康人PBMC共培养,通过流式细胞术检测PBMC中Treg细胞的比例变化及CD8+T细胞、Treg细胞的增殖能力。结果:1.白癜风患者外周血中Treg细胞在CD4+T细胞中的比例较健康对照显著降低(VP n=28,HC n=22,P0.05);患者Treg细胞的增殖能力弱于健康对照(VP n=3,HC n=3,P0.05)。2.细胞共培养实验显示,患者Treg细胞抑制PBMC增殖的能力减弱(VP n=8,HC n=8,P0.05),部分患者Treg细胞甚至促进PBMC的增殖。3.流式细胞术检测Treg细胞表面发挥抑制功能的分子CTLA-4的表达,患者Treg细胞表面该分子的表达弱于健康对照(VP n=10,HC n=5,P0.05);刺激细胞内因子分泌后检测Treg细胞内炎症因子的表达,发现患者Treg细胞分泌IFN-γ、IL-17A的能力强于健康对照(VP n=7,HC n=4,P0.05)。4.白癜风患者血清中TGF-β1、IL-10、CTLA-4的平均水平均明显低于健康对照的平均水平,经统计学分析各组P0.05(VP n=20,HC n=20)。5.患者Treg细胞中HO-1的平均荧光强度弱于健康对照(VP n=9,HC n=8,P0.05),患者HO-1阳性的Treg细胞比例降低(VP n=9,HC n=8,P0.05)。6.白癜风患者血清中HO-1、Co Hb、Fe2+、TBIL的平均水平均明显低于健康对照的平均水平,差异具有统计学意义(VP n=20,HC n=20,P0.05)。7.患者/健康对照血清处理第三方健康人PBMC,发现患者血清处理组PBMC中Treg细胞比例增高(VP n=6,HC n=7,P0.05),CD8+T细胞及Treg细胞上增殖相关分子Ki67的表达也显著增高(VP n=6,HC n=7,P0.05)。结论:通过本课题研究,我们明确白癜风患者Treg细胞数目减少且功能受损,并证实白癜风患者Treg细胞存在一定程度的功能转化,其抑制功能减弱并促进Th1、Th17型炎症因子的分泌,导致CD8+T细胞功能亢进。在此基础上,我们探讨了HO-1作为上游分子对Treg细胞功能的影响,初步明确白癜风患者HO-1的活性降低减弱Treg细胞的功能。
【关键词】：白癜风 细胞免疫 调节性T细胞 血红素氧合酶-1
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R758.41
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-15
• 文献回顾15-21
• 实验一 白癜风患者外周血Treg细胞数目及功能研究21-35
• 1 材料21-24
• 2 方法24-28
• 3 结果28-32
• 4 讨论32-35
• 实验二 HO-1 在白癜风患者Treg细胞及血清中的表达及作用35-44
• 1.材料35
• 2.方法35-38
• 3.结果38-41
• 4.讨论41-44
• 小结44-45
• 参考文献45-51
• 附录51-53
• 个人简历和研究成果53-54
• 致谢54-55

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