UVA辐射联合鸦胆子苦醇诱导人恶性黑色素瘤A375细胞凋亡的研究

发布时间：2017-06-27 06:00

  本文关键词：UVA辐射联合鸦胆子苦醇诱导人恶性黑色素瘤A375细胞凋亡的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景:黑色素瘤是一种高度恶性的皮肤肿瘤。尽管已有长期且广泛的研究,但由于内质网应激保护、过表达多种耐药性蛋白及有效的DNA修复机制等多种复杂表型,且转移速度快,恶性程度高,对化疗放疗均不敏感等特性使其难以治愈。65%的黑色素瘤患者存在BRAF基因突变,所以目前治疗黑色素瘤的研究热点是研发针对BRAF突变的靶向药物(如vemurafenib和dabrafenib)。这些药物在短期内具有较好的药效,但不到一年患者体内就会产生耐药性。基于恶性黑色素瘤的耐药性现状,我们尝试选择癌细胞中另一种重要的超表达耐药性基因—转录因子Nrf2(NF-E2 related factor 2)作为切入点,Nrf2在细胞防御保护中发挥着重要作用。鸦胆子苦醇(brusatol)作为一种独特的Nrf2抑制剂可协助化疗药物治疗肺癌,但其在恶性黑色素瘤细胞中的生物学效应及联合光疗如UVA治疗恶性黑色素瘤等方面尚未有报道。目的:采用梯度强度(25,50,75,100 k J/m2)UVA辐射,检测其对人恶性黑色素瘤A375细胞活性的影响;检测75 k J/m2 UVA辐射对A375细胞Nrf2及其靶基因HO-1、NQO1、GSTP1表达的影响;检测75 k J/m2 UVA辐射对A375细胞NF-κB信号通路相关IκBα和COX2蛋白水平的影响。检测不同浓度(10,20,30,40,50,100 n M)brusatol对A375细胞活性的影响;检测50 n M brusatol处理对A375细胞Nrf2及其靶基因HO-1、NQO1、GSTP1表达的影响;检测50 n M brusatol处理对A375细胞NF-κB信号通路IκBα和COX2蛋白表达的影响。75 k J/m2 UVA辐射后2 h再用50 n M brusatol处理A375细胞,检测Bcl-2家族Bcl-2、Bcl-xl、Bax蛋白水平变化;75 k J/m2 UVA辐射后2 h再用50 n M brusatol处理A375细胞,检测24 h后细胞Bcl-2、Bcl-xl、Bax、caspase 3、caspase 7、caspase8、caspase 9、cleaved-PARP蛋白水平变化;分别检测75 k J/m2 UVA辐射组、50 n M brusatol处理组及75 k J/m2 UVA+50 n M brusatol处理组,人正常角质形成细胞Ha Ca T和恶性黑色素瘤细胞A375的凋亡状况。研究方法:MTS法检测A375细胞的增殖活性;Western blotting电泳检测GRP78、ATF4、CHOP、Nrf2等蛋白水平;流式细胞技术检测Ha Ca T和A375细胞的凋亡状况。结果:①75 k J/m2 UVA辐射后A375细胞内Nrf2及其靶基因蛋白水平上调,IκBα和COX2蛋白水平有降低趋势。75 k J/m2 UVA辐射对A375细胞活性损伤小于10%,不会严重损伤细胞的增殖活性;Nrf2-ARE信号通路相关蛋白水平显著上升,Nrf2总蛋白水平在4-6 h左右达到最大值,随后逐渐降低。转录因子Nrf2下游抗氧化应激蛋白HO-1、NQO1、GSTP1在24 h内总体水平逐渐升高;NF-κB的抑制子IκBα蛋白水平有降低趋势。COX2蛋白水平也呈降低趋势,8 h左右蛋白水平最低,而后逐渐升高并显著高于对照组。②50 n M brusatol处理诱导A375细胞内质网应激蛋白表达升高,抑制Nrf2和GSTP1蛋白水平,IκBα水平没有显著性变化。MTS实验结果显示50 n M鸦胆子苦醇不会明显影响A375细胞活性。50 n M brusatol处理后A375细胞内质网应激蛋白GRP78、ATF4、CHOP水平呈时间依赖性高表达;Nrf2总蛋白水平逐渐降低,4 h左右降到最低值,8 h恢复后再次降低。Nrf2靶基因GSTP1蛋白水平逐步降低;IκBα蛋白水平没有显著性差异,炎症因子COX2蛋白水平明显升高。③75 k J/m2 UVA辐射联合50 n M brusatol处理后A375细胞凋亡率显著上升至30%,而单独75 k J/m2 UVA辐射细胞凋亡率约10%,50 n M brusatol处理则不会显著诱导A375细胞凋亡。联合处理后Bcl-2家族中抗凋亡的Bcl-2和Bcl-xl的蛋白水平呈时间依赖性降低趋势,促凋亡的Bax蛋白水平呈递增趋势。联合处理24 h后A375细胞内Bax、cleaved-PARP、cleaved-caspase 3与对照组相比明显升高,Bcl-2、Bcl-xl、caspase 7等蛋白水平与对照组相比明显降低。流式细胞技术检测结果显示联合处理组的凋亡率明显高于对照组和两个单独处理组。结论:①75 k J/m2 UVA辐射单独处理引起A375细胞小量凋亡;该处理能激活A375细胞的氧化应激通路。②50 n M brusatol单独处理不会引起A375细胞凋亡;该处理抑制了Nrf2-ARE信号通路,诱导A375细胞COX2的表达升高并产生内质网应激。③75 k J/m2 UVA辐射联合50 n M brusatol处理激活A375细胞线粒体凋亡通路相关蛋白,细胞凋亡率显著升高。
【关键词】：UVA 鸦胆子苦醇 氧化应激 内质网应激 凋亡
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.5
【目录】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-10
• 缩略词表10-11
• 1 绪论11-22
• 1.1 问题的提出与研究意义11
• 1.2 国内外研究现状11-20
• 1.2.1 恶性黑色素瘤的研究进展11-13
• 1.2.2 肿瘤中内质网应激的研究进展13-14
• 1.2.3 Nrf2 在肿瘤发生发展进程中的作用14-17
• 1.2.4 UV及NF-κB信号通路的研究进展17-19
• 1.2.5 细胞凋亡途径的简介19-20
• 1.3 本文研究目的和研究内容20-21
• 1.3.1 研究目的20
• 1.3.2 主要研究内容20-21
• 1.4 本文创新点21-22
• 2 UVA辐射A375 细胞产生的相关生物学效应的研究22-34
• 2.1 引言22
• 2.2 实验材料22-25
• 2.2.1 主要仪器设备22-23
• 2.2.2 实验试剂及药品23-24
• 2.2.3 相关试剂的配制24-25
• 2.3 相关实验方法25-30
• 2.3.1 A375 细胞的培养25-26
• 2.3.2 MTS检测细胞活性26
• 2.3.3 Western blot检测蛋白水平26-30
• 2.4 实验结果30-32
• 2.4.1 UVA辐射对A375 细胞活性的影响30
• 2.4.2 75 kJ/m~2 UVA辐射对A375 细胞Nrf2 信号通路和NF-κB信号通路IκBα、COX2 蛋白水平的影响30-32
• 2.5 讨论32-34
• 3 鸦胆子苦醇在A375 细胞中相关生物学效应的研究34-43
• 3.1 引言34
• 3.2 实验材料34-37
• 3.2.1 主要仪器设备34-35
• 3.2.2 实验试剂及药品35-36
• 3.2.3 相关试剂的配制36-37
• 3.3 相关试验方法37
• 3.3.1 A375 细胞的培养37
• 3.3.2 MTS检测细胞活性37
• 3.3.3 Western blot检测蛋白水平37
• 3.4 实验结果37-41
• 3.4.1 鸦胆子苦醇对A375 细胞活性的影响37-38
• 3.4.2 50 nM鸦胆子苦醇处理对A375 细胞内质网应激、Nrf2 信号通路和NF-κB信号通路IκBα、COX2 蛋白水平的影响。38-41
• 3.5 讨论41-43
• 4 UVA辐射联合鸦胆子苦醇处理诱导A375 细胞凋亡43-50
• 4.1 引言43
• 4.2 实验材料43-46
• 4.2.1 主要仪器设备43-44
• 4.2.2 实验试剂及药品44-46
• 4.2.3 相关试剂的配制46
• 4.3 相关试验方法46-47
• 4.3.1 HaCaT细胞的培养46
• 4.3.2 A375 细胞的培养46
• 4.3.3 Western blot检测蛋白水平46
• 4.3.4 流式细胞技术检测细胞凋亡46-47
• 4.4 实验结果47-49
• 4.4.1 75 kJ/m~2 UVA辐射 2h后 50 nM鸦胆子苦醇处理A375 细胞，激活线粒体介导的凋亡途径47-48
• 4.4.2 联合处理诱导A375 细胞凋亡率显著升高，HaCaT细胞凋亡率则没有明显变化48-49
• 4.5 讨论49-50
• 5 结论与展望50-51
• 5.1 本研究的主要结论50
• 5.2 后期研究的展望50-51
• 致谢51-52
• 参考文献52-63

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