4.1B对小鼠黑色素瘤细胞增殖、迁移和上皮间质转化的影响

发布时间：2017-07-06 11:13

  本文关键词：4.1B对小鼠黑色素瘤细胞增殖、迁移和上皮间质转化的影响

  更多相关文章： 肿瘤转移 黑色素瘤 4.1B 增殖 EMT

【摘要】：研究目的目前,黑色素瘤已经成为全球发病率增长最快的恶性肿瘤之一。肿瘤转移导致传统治疗方法不能取得理想的效果,因此,有效抑制肿瘤转移可以改善黑色素瘤的治疗效果。EMT在肿瘤转移、干细胞性、耐药性中发挥重要作用,因此寻找EMT相关的负调控因子,对恶性肿瘤的预防和预后都具有重要意义。蛋白4.1B是一种骨架蛋白,已有研究表明在多种肿瘤中蛋白4.1B呈现不同程度的表达下调或缺失,可能是一种潜在的肿瘤抑制因子。我们在前期研究中发现4.1B在B16和B16-F10细胞中均呈现表达缺失,构建pEGFP-N1-EPB41L3真核表达载体,探究4.1B在黑色素瘤细胞转移中的作用。将外源性的EPB41L3基因转染4.1B缺失表达的黑色素瘤细胞系,探讨其对细胞的增殖和迁移能力的影响,以及在B16皮下移植瘤和B16-F10肺转移中的作用,并初步探索4.1B调控黑色素瘤细胞EMT的分子机制。方法1.PCR和western blot技术筛选蛋白4.1家族在黑色素瘤细胞B16和B16-F10中的表达情况;荧光定量PCR进一步检测EPB41L3基因的表达情况。2.构建pEGFP-N1-EPB41L3真核表达载体,转染B16和B16-F10细胞,荧光显微镜观察蛋白4.1B在黑色素瘤细胞内的定位情况,PCR、荧光定量PCR以及western blot实验方法检测蛋白4.1B的表达情况。3.MTT法检测蛋白4.1B对黑色素瘤细胞体外增殖的影响,细胞划痕实验检测蛋白4.1B对其迁移能力的影响。4.荧光定量PCR和western blot技术检测EMT相关标志物E-cadherin、vi mentin、MMP-2、MMP-9的表达情况。荧光定量PCR检测启动EMT相关的T GF-β家族成员、转录因子Snail、Slug、Twist 2基因的表达量。5.荧光定量PCR技术检测蛋白4.1B对integrinβ1基因水平表达量的影响。流式细胞术检测蛋白4.1B对细胞表面integrinβ1的表达以及活化的影响。6.B16皮下移植瘤模型以及B16-F10肺转移模型评估蛋白4.1B的抑癌功能。结果1.小鼠黑色素瘤细胞系B16和B16-F10中,4.1R、4.1N、4.1G在核酸和蛋白水平均正常表达,但是蛋白4.1B在两种细胞中都呈现表达缺失。2.成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-EPB41L3,EPB41L3基因转染细胞后荧光显微镜镜检,可观察到绿色荧光。PCR、荧光定量PCR和western blot技术检测结果显示EPB41L3基因转染后细胞均表达4.1B。3.蛋白4.1B对黑色素瘤细胞系B16和B16-F10细胞的体外增殖以及迁移具有抑制作用。4.蛋白4.1B表达后,上皮型标志物E-cadherin的表达出现明显上调,间充质型标志物vimentin、MMP-9的表达出现下调。蛋白4.1B可能通过抑制转录因子Snail、Slug、Twist 2基因的表达抑制EMT。5.蛋白4.1B对细胞表面integrinβ1的表达和活化没有影响。6.蛋白4.1B对B16皮下移植瘤和B16-F10肺转移具有一定的抑制作用。结论蛋白4.1B对B16和B16-F10细胞的增殖和迁移具有抑制作用,并且能够通过下调相关转录因子Snail、Slug、Twist 2的表达水平,调节EMT相关标志物E-cadherin、vimentin、MMP-9的表达,从而抑制黑色素瘤细胞EMT,抑制肿瘤细胞的转移。动物实验结果进一步证实了蛋白4.1B能够显著性抑制B16皮下移植瘤的生长,对小鼠肺转移模型中B16-F10的肺转移也具有一定的抑制作用。
【关键词】：肿瘤转移 黑色素瘤 4.1B 增殖 EMT
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.5
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-14
• 常见英文缩写一览表（文中先后顺序）14-16
• 第一章 引言16-23
• 1.1 黑色素瘤16
• 1.2 肿瘤转移16-17
• 1.3 上皮间质转化17-18
• 1.4 蛋白 4.1B18-20
• 1.5 研究目的与意义20
• 1.6 研究内容与方法20-22
• 1.7 技术路线22-23
• 第二章 蛋白 4.1 家族在小鼠黑色素瘤细胞中的表达筛选23-38
• 2.1 材料23-26
• 2.1.1 细胞株23
• 2.1.2 主要试剂23-24
• 2.1.3 主要仪器24-25
• 2.1.4 常用试剂配制25-26
• 2.2 方法26-35
• 2.2.1 细胞培养的常规方法26-28
• 2.2.2 PCR法检测蛋白 4.1 家族基因的表达情况28-30
• 2.2.3 Western blot技术检测蛋白 4.1 家族的表达30-33
• 2.2.4 荧光定量PCR检测EPB41L3基因的表达33-35
• 2.2.5 统计学分析35
• 2.3 结果35-37
• 2.3.1 PCR法初步筛选蛋白 4.1 家族的表达35-36
• 2.3.2 Western blot法检测蛋白 4.1 家族的表达情况36-37
• 2.3.3 荧光定量PCR法检测EPB41L3基因的表达情况37
• 2.4 讨论37-38
• 第三章 真核表达载体p EGFP-N1-EPB41L3的构建和表达38-56
• 3.1 材料38-40
• 3.1.1 细胞株38
• 3.1.2 主要试剂38-39
• 3.1.3 主要仪器39-40
• 3.1.4 常用试剂配制40
• 3.2 方法40-46
• 3.2.1 小鼠EPB41L3基因的扩增40-41
• 3.2.2 真核表达载体p EGFP-N1-EPB41L3的构建41-43
• 3.2.3 荧光显微镜检测 4.1B融合蛋白的表达43-44
• 3.2.4 PCR检测EPB41L3的表达44
• 3.2.5 荧光定量PCR法检测EPB41L3基因的表达情况44-45
• 3.2.6 Western blot法检测蛋白 4.1B45
• 3.2.7 统计学分析45-46
• 3.3 结果46-55
• 3.3.1 小鼠EPB41L3基因的扩增结果46
• 3.3.2 绘制小鼠EPB41L3基因的外显子图谱46-47
• 3.3.3 真核表达载体p EGFP-N1-EPB41L3的鉴定47-50
• 3.3.4 荧光显微镜观察 4.1B在细胞内的表达情况50-52
• 3.3.5 PCR检测EPB41L3基因的表达情况52
• 3.3.6 荧光定量PCR检测EPB41L3基因的表达情况52-53
• 3.3.7 Western blot法检测B16和B16-F10细胞表达蛋白 4.1B53-55
• 3.4 讨论55-56
• 第四章 4.1B对B16、B16-F10细胞体外增殖和迁移的影响56-63
• 4.1 材料56
• 4.1.1 细胞株56
• 4.1.2 主要试剂56
• 4.1.3 主要仪器56
• 4.1.4 常用试剂配制56
• 4.2 方法56-59
• 4.2.1 MMT法检测蛋白 4.1B抑制B16的体外增殖56-57
• 4.2.2 MTT法检测蛋白 4.1B抑制B16-F10的体外增殖57-58
• 4.2.3 划痕实验检测蛋白 4.1B对细胞迁移的影响58
• 4.2.4 统计学分析58-59
• 4.3 结果59-62
• 4.3.1 蛋白 4.1B抑制B16细胞的体外增殖59-60
• 4.3.2 蛋白 4.1B抑制B16-F10细胞的体外增殖60-61
• 4.3.3 蛋白 4.1B抑制黑色素瘤细胞系B16、B16-F10的迁移61-62
• 4.4 讨论62-63
• 第五章 4.1B抑制黑色素瘤细胞EMT的机制研究63-75
• 5.1 材料63-64
• 5.1.1 细胞株63
• 5.1.2 主要试剂63-64
• 5.1.3 主要仪器64
• 5.1.4 常用试剂配制64
• 5.2 方法64-67
• 5.2.1 荧光定量PCR检测EMT相关基因的表达64-65
• 5.2.2 Western blot法检测EMT相关蛋白的表达情况65-66
• 5.2.3 流式细胞术检测integrin β1 的表达和活化66-67
• 5.2.4 统计学分析67
• 5.3 结果67-73
• 5.3.1 蛋白 4.1B影响EMT相关marker的表达67-68
• 5.3.2 蛋白 4.1B对TGF-β 家族成员的影响68-69
• 5.3.3 蛋白 4.1B抑制驱动EMT的相关转录因子69-70
• 5.3.4 蛋白 4.1B对MMP-2 和MMP-9 的影响70-71
• 5.3.5 蛋白 4.1B对integrinβ1 的影响71-73
• 5.4 讨论73-75
• 第六章 小鼠皮下移植瘤和肺转移动物实验验证 4.1B功能75-80
• 6.1 材料75-76
• 6.1.1 细胞株75
• 6.1.2 主要试剂75
• 6.1.3 主要仪器75
• 6.1.4 常用试剂配制75-76
• 6.1.5 实验动物76
• 6.2 方法76-77
• 6.2.1 蛋白 4.1B对B16皮下移植瘤的影响76
• 6.2.2 蛋白 4.1B对B16-F10肺转移的影响76-77
• 6.2.3 统计学分析77
• 6.3 结果77-79
• 6.3.1 蛋白 4.1B对B16皮下移植瘤的影响77-78
• 6.3.2 蛋白 4.1B对B16-F10肺转移的影响78-79
• 6.4 讨论79-80
• 第七章 全文讨论80-82
• 全文结论82-83
• 参考文献83-88
• 个人简历、硕士期间发表的学术论文及研究成果88-89
• 致谢89

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