白色海绵状斑痣—家系角蛋白13基因突变位点研究

发布时间：2017-08-22 17:33

  本文关键词：白色海绵状斑痣—家系角蛋白13基因突变位点研究

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【摘要】：目的:寻找白色海绵状斑痣(white sponge nevus,WSN)家系角蛋白K13(keratin 13,K13或KRT13)基因突变,研究角蛋白13基因(k13)突变位点对K13在组织与细胞中表达水平的影响。方法:收集一个WSN家系,此家系现存9人,WSN患者2人。抽取该家系中5人外周静脉血各5ml作为实验组,另抽取3名健康人外周静脉血各5ml作为对照组,经过PCR扩增后基因组测序,以NCBI数据库人标准碱基序列作对比,分析基因突变位点。应用免疫组化技术,检测该家系中患者口腔黏膜组织中K13表达水平,以人正常口腔黏膜组织、口腔白斑组织做对照,进行分析对比。以RNAi慢病毒为工具,针对k13基因构建突变载体,感染人永生化表皮细胞(HaCaT),构建角蛋白k13基因敲减与角蛋白k13基因c.T3222C(p.L409P)突变细胞模型,和未经处理的人永生化表皮细胞做对照,运用WB技术检测该模型细胞中角蛋白K13的表达水平,运用MTT细胞检测技术检测模型细胞的增殖效率。结果:WSN患者与正常人群DNA序列分析发现10个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP),经家系分析及对照组分析初步将c.T3222C(p.L409P)确定为致病基因。该家系中2例患者口腔黏膜组织角蛋白K13在棘细胞层表达水平较正常人降低(p0.05)。细胞模型构建实验中,k13基因敲减模型细胞中角蛋白K13无表达,k13基因c.T3222C(p.L409P)突变细胞模型中角蛋白K13表达水平较空白对照组降低。MTT细胞检测表明,两组模型中细胞的增殖效率均较空白对照组提高。证实k13基因c.T3222C(p.L409P)突变是导致WSN的原因。结论:本研究所收集的WSN家系患者k4、k13基因存在10个单核苷酸多态性,其中k13基因c.T3222C(p.L409P)为致病基因。细胞水平研究显示WSN患者k13基因突变与其口腔黏膜上皮角蛋白表达水平降低、细胞增殖效率提高的关系,同时解释了WSN患者口腔黏膜出现增厚的白色海绵状斑块的临床现象。这一发现增加了k13的基因突变谱。
【关键词】：白色海绵状斑痣 基因突变 角蛋白13
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R758.51
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 前言11-14
• 材料和方法14-28
• 1. 实验材料与仪器14-17
• 2. 实验方法17-28
• 2.1 病例选择17-21
• 2.2 基因组DNA抽提和PCR测序21-23
• 2.3 WSN 组织中角蛋白 K13 免疫组化检测23-24
• 2.4 k13 基因突变细胞模型实验24-28
• 结果28-37
• 讨论37-40
• 结论40
• 参考文献40-44
• 附录1 白色海绵状斑痣患者角蛋白k 13 基因突变 ( 综述 )44-50
• 参考文献48-50
• 致谢50-51

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