梅毒螺旋体鞭毛蛋白免疫活性分析及其诱导HaCaT细胞表达基质金属蛋白酶的分子机制

发布时间：2017-08-22 18:15

  本文关键词：梅毒螺旋体鞭毛蛋白免疫活性分析及其诱导HaCaT细胞表达基质金属蛋白酶的分子机制

  更多相关文章： 梅毒螺旋体 鞭毛蛋白 血清学诊断 基质金属蛋白酶 角质形成细胞

【摘要】：背景与目的:梅毒是由梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)引起的严重危害人类健康的性传播疾病,其传播途径与艾滋病相同,且可明显增加感染和传播艾滋病的危险性。近年来梅毒发病率跃居我国各类性传播疾病之首,快速准确的诊断对于预防和控制梅毒具有重要意义。迄今为止,Tp的致病机制和致病物质仍不清楚,细菌鞭毛蛋白作为一种经典病原相关分子模式,在促进病原体侵袭和诱导宿主炎症反应中发挥重要作用。角质形成细胞是皮肤屏障中重要的免疫前哨细胞,参与皮肤免疫炎症反应。因此,我们推测:Tp鞭毛蛋白可能通过诱导角质形成细胞表达基质金属蛋白酶,进而降解细胞外基质,引起皮肤免疫炎症反应并促进Tp侵袭。本研究旨在通过原核表达重组Tp鞭毛蛋白,分析其免疫原性和免疫反应性,评价其是否具有候选抗原的价值。同时,以人皮肤角质形成细胞为靶细胞,明确Tp鞭毛蛋白能否通过TLR5激活角质形成细胞表达基质金属蛋白酶,阐明Tp鞭毛蛋白诱导角质形成细胞基质金属蛋白酶的相关信号通路。本研究将为阐明Tp分子致病机制提供新思路和依据,对梅毒防控具有重要现实意义。方法:1.以Tp Nichols标准株基因组DNA为模板,PCR扩增Tp鞭毛蛋白Fla B1、Fla B2和Fla B3全基因片段;构建p ET28a-Fla B1(Fla B2、Fla B3)原核表达载体;酶切、测序鉴定后,转化至表达宿主菌E.coli BL21(DE3)中。2.IPTG诱导重组鞭毛蛋白Fla B1、Fla B2、Fla B3表达,Western Blot对表达产物进行分析和鉴定;用Ni2+-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白,BCA法测定蛋白浓度。3.以Tp Nichols株,Chicago株和Tp临床分离株(nhgz01和nhgz02)建立梅毒感染动物模型,收集感染兔血清,Western Blot检测重组鞭毛蛋白Fla B1、Fla B2、Fla B3与感染兔血清和梅毒患者血清的免疫反应性。4.重组鞭毛蛋白Fla B1、Fla B2、Fla B3免疫新西兰兔,收集免疫血清,Western Blot和ELISA法检测重组蛋白的免疫原性和免疫反应性。5.建立重组鞭毛蛋白Fla B1、Fla B2、Fla B3 ELISA方法,检测各期梅毒患者血清、交叉血清及阴性血清中特异性Ig G和Ig M,初步评价重组蛋白Fla B1、Fla B2、Fla B3在梅毒血清学诊断中的应用价值。6.培养人永生化的角质形成细胞(Ha Ca T),以10μg/m L Fla B1、Fla B2、Fla B3分别刺激Ha Ca T细胞48h后,蛋白芯片检测基质金属蛋白酶的表达变化。7.以不同浓度0.1、1、10μg/m L Fla B1、Fla B2、Fla B3分别刺激Ha Ca T细胞24h后,RT-PCR检测MMP-9、MMP-13的m RNA表达水平,明胶酶谱实验和Western Blot检测MMP-9的活性和表达水平,ELISA法检测MMP-13的表达水平。8.Ha Ca T细胞转染2μg TLR5、TLR2、TLR4、My D88特异性干扰质粒和对照质粒后培养24h,随后用10μg/m L Fla B1、Fla B2、Fla B3刺激培养48h,Western Blot和ELISA分别检测MMP-9、MMP-13的表达变化。9.分别用终浓度为10μg/m L的Fla B1、Fla B2、Fla B3刺激Ha Ca T细胞15min、30min、60min、120min后,Western Blot检测ERK、JNK、p38磷酸化水平。10.分别用终浓度为10μg/m L的Fla B1、Fla B2、Fla B3刺激Ha Ca T细胞15min、30min、60min、120min后,Western Blot检测细胞中总IκBα的降解水平,磷酸化IκBα的表达水平。用10μg/m L的Fla B1、Fla B2、Fla B3刺激Ha Ca T细胞2h后,免疫荧光检测NF-κB p65亚基核转位情况。11.采用特异性抑制剂ERK(10μM PD98059)、JNK(20μM SP600125)、p38MAPK(10μM SB203580)、NF-κB(10μM BAY117082)预处理Ha Ca T细胞后,用终浓度为10μg/m L Fla B1、Fla B2、Fla B3刺激Ha Ca T细胞48h,Western Blot和ELISA分别检测MMP-9、MMP-13的表达变化。结果:1.PCR扩增获得与目的片段大小相符的基因片段:Fla B1(861bp)、Fla B2(861bp)、Fla B3(858bp),重组质粒经测序鉴定与目的基因一致。2.IPTG诱导表达出相对分子量约为36 k Da(Fla B1),35 k Da(Fla B2),34 k Da(Fla B3)的目的蛋白,经Ni2+-NTA纯化后BCA测定浓度约为2mg/m L。3.在新西兰兔感染Tp Nichols标准株,Chicago株及Tp临床分离株(nhgz-01和nhgz-02)后获取的梅毒感染兔血清,以及梅毒患者血清中均检测到Fla B1、Fla B2和Fla B3特异性抗体的表达。4.Tp鞭毛蛋白Fla B1、Fla B2、Fla B3在初次免疫后7天,抗血清中即可检测出鞭毛蛋白的相应Ig G抗体,三次免疫后获取的免疫血清效价达到1:51200。5.各蛋白Ig G ELISA总的敏感性分别为:Fla B1(95.4%)、Fla B2(92.6%)和Fla B3(95.1%),在Ig M ELISA中,重组蛋白对一期梅毒和先天梅毒表现了较好的敏感性,其敏感性分别为:Fla B1(76.8%,83.1%)、Fla B2(72.0%,87.7%)和Fla B3(74.4%,89.2%);Ig G ELISA总的特异性分别为:Fla B1(98.9%)、Fla B2(95.8%)和Fla B3(95.8%),在Ig M ELISA中,其特异性分别为:Fla B1(96.8%)、Fla B2(97.9%)和Fla B3(95.8%)。6.鞭毛蛋白诱导Ha Ca T表达多种MMPs和TIMP,其中MMP-13,TIMP-1,TIMP-2在三组中表达量均明显升高;仅Fla B1可诱导MMP-9的表达量显著升高。7.Fla B1诱导MMP-9 m RNA和蛋白表达呈浓度依赖性,10μg/m L Fla B1可诱导MMP-9 m RNA和蛋白表达水平显著升高。MMP-13 m RNA和蛋白表达水平也呈浓度依赖性,当蛋白浓度达到10μg/m L时,可引起MMP-13 m RNA和蛋白表达水平显著升高。8.Ha Ca T细胞转染TLR5和My D88干扰质粒后可显著抑制MMP-9、MMP-13的表达,而转染TLR2和TLR4干扰质粒后,MMP-9、MMP-13的表达量无明显改变。9.Fla B1、Fla B2、Fla B3刺激Ha Ca T细胞后可诱导ERK、JNK、p38发生不同程度磷酸化且呈一定的时间依赖性。10.Fla B1、Fla B2、Fla B3刺激Ha Ca T细胞后,IκBα发生不同程度的降解和磷酸化且呈一定的时间依赖性。Fla B1、Fla B2、Fla B3刺激Ha Ca T细胞2h后,NF-κB p65亚基发生了不同程度的核转位。11.Ha Ca T细胞采用特异性抑制剂处理后,Fla B1诱导MMP-9的表达量被显著抑制,但是p38特异性抑制剂SB203580处理细胞后,MMP-13的表达水平与对照组比较,无显著性差异。结论:1.梅毒螺旋体鞭毛蛋白Fla B1、Fla B2和Fla B3具有较强免疫活性,能够诱导机体产生特异性免疫应答,可做为梅毒血清诊断候选抗原。2.梅毒螺旋体鞭毛蛋白Fla B1、Fla B2和Fla B3经TLR5/My D88依赖途径激活Ha Ca T细胞表达MMP-9和MMP-13。3.MAPK和NF-κB信号通路参与调控梅毒螺旋体鞭毛蛋白Fla B1、Fla B2和Fla B3诱导Ha Ca T细胞表达MMP-9和MMP-13。
【关键词】：梅毒螺旋体 鞭毛蛋白 血清学诊断 基质金属蛋白酶 角质形成细胞
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R759.1
【目录】：

• 摘要4-9
• Abstract9-15
• 中英文缩略词15-19
• 前言19-23
• 第一章 梅毒螺旋体鞭毛蛋白Fla B1、Fla B2、Fla B3的克隆、表达与纯化23-49
• 1 材料25-28
• 2 方法28-40
• 3 结果40-48
• 4 讨论48
• 5 小结48-49
• 第二章 梅毒螺旋体鞭毛蛋白Fla B1、Fla B2、Fla B3免疫活性分析49-71
• 1 材料51-53
• 2 方法53-57
• 3 结果57-67
• 4 讨论67-70
• 5 小结70-71
• 第三章 梅毒螺旋体鞭毛蛋白Fla B1、Fla B2、Fla B3诱导Ha Ca T细胞表达基质金属蛋白酶的分子机制71-121
• 1 材料73-76
• 2 方法76-87
• 3 结果87-116
• 4 讨论116-120
• 5 小结120-121
• 结论121-123
• 参考文献123-133
• 文献综述133-151
• 参考文献143-151
• 附录151-159
• 攻读学位期间的科研成果159-161
• 本研究受以下基金资助161-163
• 致谢163

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 马强;耿焱;黄茂梁;吴英松;李明;;梅毒螺旋体0751基因的克隆、表达及鉴定[J];热带医学杂志;2011年06期

2 杨秋;揭开梅毒螺旋体的基因真相[J];国外科技动态;1999年05期

3 强军,张会孝,张经华;对一例涉外梅毒螺旋体感染者的处理[J];口岸卫生控制;2000年02期

4 黄建香 ,余崇镐 ,林伟珍;梅毒螺旋体的检测结果分析[J];现代医药卫生;2002年11期

5 周毅;老年梅毒螺旋体感染51例调查与分析[J];中国现代医药杂志;2004年05期

6 刘鹏,冯国基;梅毒螺旋体的检测技术与应用现状[J];实用医药杂志;2005年10期

7 王华;雷丽明;李代渝;;梅毒螺旋体血清学检测方法及应用[J];实用诊断与治疗杂志;2006年09期

8 孔秋虹;;不同检测方法对梅毒螺旋体感染的评价[J];现代中西医结合杂志;2008年07期

9 凌聪;;三种梅毒螺旋体检测方法的临床评价[J];河北医学;2008年03期

10 韩洁;张海萍;朱威;连石;;梅毒螺旋体相关膜蛋白的研究进展[J];中华临床医师杂志(电子版);2010年10期

中国重要会议论文全文数据库 前9条

1 张俊艳;刘全忠;;梅毒螺旋体的检测方法及应用[A];中华医学会第十五次全国皮肤性病学术会议论文集[C];2009年

2 李秀玉;王培昌;杨珑;李文军;;梅毒螺旋体检测方法及应用[A];中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编[C];2011年

3 许友强;李慧源;;梅毒螺旋体特异性IgG抗体亲和力的测定及其临床意义的研究[A];中华医学会第八次全国检验医学学术会议暨中华医学会检验分会成立30周年庆典大会资料汇编[C];2009年

4 庄亦晖;陈瑜;蒋燕群;;Determine Syphilis TP方法在梅毒螺旋体血清学诊断中的临床评价[A];中华医学会第八次全国检验医学学术会议暨中华医学会检验分会成立30周年庆典大会资料汇编[C];2009年

5 唐书谦;叶庆佾;;刚果红染色法检查梅毒螺旋体[A];2003中国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C];2003年

6 王林娜;郑和义;;梅毒螺旋体基因检测以及治疗前后螺旋体DNA载量变化的研究[A];中华医学会第14次全国皮肤性病学术年会论文汇编[C];2008年

7 刘双全;赵飞骏;张秋桂;吴移谋;;梅毒螺旋体Tp0751黏附蛋白的表达、纯化及免疫活性研究[A];中华医学会第八次全国检验医学学术会议暨中华医学会检验分会成立30周年庆典大会资料汇编[C];2009年

8 梁平;汤伍辉;邵群;李慧英;李彬;魏建萍;;梅毒螺旋体IgM蛋白印迹试验诊断先天性梅毒评价[A];江西省第五次中西医结合皮肤科学术交流会论文集[C];2006年

9 莫颖;林晶;陈万;梁云燕;刘晓芳;关善斌;梁纲;莫书荣;;吸毒者与HCV、HIV及梅毒螺旋体感染的相关研究[A];中南地区第六届生理学学术会议论文摘要汇编[C];2004年

中国重要报纸全文数据库 前4条

1 江西医学院二附院 主任医师 俞景明;梅毒螺旋体：我的自白[N];家庭医生报;2004年

2 湖南省性病控制中心 丁胜非;怎样看梅毒化验单[N];大众卫生报;2000年

3 本报记者 李振辉 通讯员 刘东红;哪些性病症状 会表现在眼部[N];广东科技报;2008年

4 由它;眼睛也会被性病毒伤害[N];保健时报;2005年

中国博士学位论文全文数据库 前5条

1 田洪青;山东地区梅毒螺旋体基因分型研究[D];安徽医科大学;2014年

2 蒋传好;梅毒螺旋体鞭毛蛋白免疫活性分析及其诱导HaCaT细胞表达基质金属蛋白酶的分子机制[D];南华大学;2016年

3 张良芬;编码梅毒螺旋体47-、17-和15kD脂蛋白的基因克隆、表达及表达产物反应原性的初步鉴定[D];中国协和医科大学;2001年

4 戴婷;上海地区梅毒患者梅毒螺旋体基因分型及与神经梅毒相关性的初步研究[D];北京协和医学院;2012年

5 龙福泉;梅毒螺旋体膜蛋白的表达、纯化及其免疫活性的研究[D];北京协和医学院;2012年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 薛爱凤;莱城区育龄妇女孕前五种病原体感染状况及相关因素分析[D];泰山医学院;2014年

2 史金龙;新疆梅毒螺旋体大环内酯类抗生素耐药基因突变位点23SrRNA2058G检测[D];新疆医科大学;2016年

3 陈洁;梅毒螺旋体的免疫组化法检测意义[D];浙江大学;2012年

4 李珍;梅毒螺旋体大环内酯类抗生素耐药基因突变位点检测[D];济南大学;2014年

5 肖洁;梅毒螺旋体特异诊断抗原的筛选、制备及临床应用初探[D];第三军医大学;2007年

6 牛淑会;梅毒螺旋体候选诊断抗原的表达及临床初步应用[D];南华大学;2012年

7 甘霖;梅毒螺旋体膜蛋白Tp92致炎作用机制的初步研究[D];南华大学;2015年

8 汤镇;重庆地区梅毒螺旋体基因分型及其临床相关性研究[D];重庆医科大学;2015年

9 刘小军;梅毒螺旋体Tp0463蛋白的表达及其在临床血清学诊断中应用的初步评价[D];南华大学;2011年

10 朱洪;梅毒螺旋体粘附素Tp0751重组菌影制备与免疫活性的初步研究[D];南华大学;2015年

，

本文编号：720633